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Jun 18, 2023

ゲル内でベシクルを作成、捕捉、変形させる簡単な方法

Rapporti scientifici Volume 13,

Scientific Reports volume 13、記事番号: 5375 (2023) この記事を引用

1406 アクセス

5 オルトメトリック

メトリクスの詳細

我々は、アガロースゲルに閉じ込められた巨大な脂質擬似小胞（上部に油性のキャップを持つ小胞）を生成する簡単な方法を紹介します。 この方法は、通常のマイクロピペットのみを使用して実行でき、液体アガロース中での水/油/水の二重液滴の形成に依存します。 私たちは、生成された小胞を蛍光イメージングで特徴付け、\(\alpha \)-溶血素膜貫通タンパク質の挿入の成功により脂質二重層の存在と完全性を確立します。 最後に、ゲルの表面をへこませることで、小胞を非侵入的に簡単に機械的に変形できることを示します。

小胞は、細胞の区画化を模倣し、ボトムアップアプローチで in vitro での特異的な生物学的機能を再現するために広く使用されてきました 1,2。 最近の多くの研究では、タンパク質 3 や遺伝子 4 を発現させたり、アクチン皮質 5 や微小管アスター 6 などの細胞骨格のタンパク質フィラメントを再構成して研究したりするために、小胞内部の複雑な生物学的反応のカプセル化に焦点が当てられています。 他の多くの研究は、リポソームへの膜貫通タンパク質の挿入を介して、例えば膜融合 7、8、9 や細胞コミュニケーションなどの細胞膜の特性を模倣することを目的としています。 特に、機械感受性チャネル 10,11 がリポソームの膜に挿入されており、機械的ストレス下でのコンダクタンスの測定が可能になっています。

小胞の生成は通常、水和法または反転エマルションテンプレートのいずれかに依存します。 水和方法は、水性緩衝液中での乾燥脂質フィルムの膨潤に依存します12、13。 それらは操作が比較的簡単ですが、多分散の小胞サイズと比較的非均一なカプセル化効率をもたらします14、15、16。 単層ベシクルの生成速度は、電場（エレクトロフォーメーション法 17）を使用することで改善できますが、壊れやすいタンパク質は印加電場によって損傷を受ける可能性があり 18,19、この技術もイオン濃度の低い緩衝液に限定されます。 一方、反転エマルジョン テンプレートは、油中水型エマルジョン液滴が水/油界面を強制的に通過することに基づいています 5,20。 この方法はマイクロ流体チップ 21、22、23、24 で開発することができ、マイクロ流体チャネルの寸法によって制限される単分散の小胞サイズが得られます。

どちらの方法（水和またはエマルジョン）でも、結果として生じる小胞は外部媒体中に分散されるため、異なる環境（マイクロピペット 25、光トラッピング 26 など）で小胞を処理または移送するには追加の手順が必要です。 これらの追加の手順は特定の技術スキルに依存するため、多くの実験を再現し、システム特性に関する大規模な統計を収集することが困難になります。 特に、機械的伝達プロセスを研究するには、小胞を機械的に刺激する必要があります。 実際には、これは通常、局所的な膜の変形 (ピペット吸引 27、流体の流れ 28、29、AFM30、31) によって達成されます。 ただし、これらの方法は、組織内の機械的摂動の性質を忠実に再現するものではありません。 さらに、彼らは細胞とその生物学的粘弾性環境の間の機械的結合を見落としています。

我々はここで、生体模倣擬似小胞（上部に油性キャップを持つ小胞）を簡単に作製するための多用途プラットフォームを提供するだけでなく、それらの捕捉と非侵入的な機械的励起も可能にする新しい技術を提案します。

(a-f) (上段) ダブルエマルションの製造方法のスケッチ。 緑/オレンジ/青の色はそれぞれ内相/油相/外相を表します。 (下段) 明視野像。 スケール バー = 500 \(\mu \)m。 (f) で生成された二重エマルション液滴は液体アガロース中で沈降し、最終的にはアガロースがゲル化するときに捕捉されます。 同時に、周囲の油殻が液滴の上部でクリーム状になり、脂質二重層が下部で開閉します。 数分後、(g) に示すように、擬似小胞が形成され、ゲル内にトラップされます。 下のパネル: アガロースゲルに捕捉されたカルボキシフルオレセインが充填された擬似小胞の蛍光顕微鏡画像。 スケール バー = 200 \(\mu \)m。

小胞は、液体の温かいアガロース溶液中に形成される、脂質を含む油滴構造の水から生成されます (化学物質の詳細は「方法」セクションを参照)。 まず、2.5 \(\μ \) L マイクロピペット (Eppendorf) を使用して、少量 (約 500 nL) の内水相を採取します (図 1a)。 次に、ピペットを油/脂質容器に移動し、チップを油に浸した状態でマイクロピペットの調整ホイールを回して、約 50 nL を吸引します (図 1b)。 したがって、ピペットチップには油/水のサンドイッチが含まれています。 最後に、ピペットを温かいアガロース溶液 (温度 \(T\約 38\,^{\circ }C\)、詳細は「方法」セクションを参照) に移動し、そこで後方に回して油/水のサンドイッチを排出します。マイクロピペットの調整ホイール。 この排出段階では、最初に油相が液体アガロース中で液滴に成長し (図 1c)、続いて水相がその内部で成長します (図 1d、e)。 最後に、ピペットを空中で急速に上昇させます。これにより、アガロース溶液からの粘性摩擦により、二重液滴がチップから剥がれます（図1f）。

したがって、その形成直後、内部の水滴はリン脂質を含む油層に囲まれています。 したがって、これらの脂質は両方の油水界面で再分布し、その親水性ヘッドは一方の側では内水相に向けられ、もう一方の側ではアガロース溶液に向けられます。 アガロース溶液が冷える間に、二重液滴はアガロース溶液中でゆっくりと沈降し、最終的には形成されたゲルに捕捉されます。 この冷却プロセス中に、二重液滴の油層が重力によってクリーム化してオイルキャップを形成する一方、元の油/水界面を安定化させる脂質が液滴の下部にある脂質二重層を押し上げます（図1g）。 二重液滴は擬似ベシクルとなる。 この単純なマイクロピペット法により、直径 601 \(\pm 58 \mu \)m の擬似小胞が得られます (N = 98)。 より小さなチップとマイクロインジェクターを使用すると、より小さなサイズを得ることができます (「方法」セクションを参照)。 この方法の生成率は 1 分あたり約 5 個の疑似小胞で、全体の成功率は約 30% です。 擬似小胞は、ゲルに捕捉されると数時間は安定しており、ゲルを含むキュベットが蒸発を防ぐために密封されていれば一晩保存できます。 さらに、擬似小胞はゲル内に閉じ込められているため、32 のように顕微鏡で容易に観察できます。

擬似小胞の特徴を明らかにし、脂質二重層の存在を調べるために、まず、両方の内水相に分散した蛍光マーカー (カルボキシフルオレセイン、発光波長 \(\lambda _c = 525\) nm、緑色、「方法」セクションを参照) を使用しました。 ) および油相 (ナイルレッド、発光波長 \(\lambda _n = 636\) nm、赤色)。 疑似小胞は上記のようにアガロースゲル内で生成され、さらに 4 倍の対物レンズを備えた共焦点顕微鏡を使用して画像化されます。 緑と赤の両方のチャネルからの蛍光画像が記録され（図2aを参照）、蛍光水相が擬似小胞に効率的にカプセル化されていることを示しています。 次に、ナイルレッドで標識した油相に存在する脂質混合物に緑色蛍光脂質 (NBD-PC、1wt%) を添加しました。 共焦点顕微鏡によって得られた合成画像を図2bに示します。 図 2c では、各チャネルの正規化された動径強度プロファイル (\((I(r)-I(0))/(I_{\textrm{cap}}+I(0))\) をプロットします。ここで \ (I_{\textrm{cap}}\) は、特定のチャネルのオイル キャップの強度です。これらのプロファイルは、内側の水相と外側のアガロース ゲルの境界にある脂質から生じる蛍光シグナルの大幅な増加を示しています。逆に、油相から生じる蛍光シグナルは検出できず、共焦点顕微鏡の空間分解能および蛍光イメージング感度の限界では、二重層中に測定可能な油層が存在しないことを示しています。内相が、大量の油分を含まない脂質二重層に効率的にカプセル化されていることを確認しましたが、これは、エマルジョンテンプレート形成小胞で証明されているように、二重層内にサブマイクロメートルの長さのスケールで油の痕跡が存在する可能性を排除するものではありません33。膜中のそのような油残留物は膜の機械的特性や機能を著しく損なわないことが示されている34。 膜張力 \(\gamma _b\) は、水相および寒天相とオイル キャップの接触角から推定でき (補足情報を参照)、\(\gamma _b = 4.15 \pm 0.33\) mN/m (これは、電気鋳造された脂質小胞で通常報告される値 35,36、\(\gamma _b \sim 10^{-3}\) mN/m よりもはるかに大きいです。 それどころか、私たちの膜張力値は、油+脂質混合物に浸した2つの水滴を接触させることによって得られる平面脂質二重層である液滴界面二重層（DIB）で得られた値とよく匹敵します（たとえば37、38、39を参照）。 DIB では、脂質二重層を取り囲む水/油界面も存在します。 したがって、擬似小胞で測定した高い \(\gamma _b\) 値は、DIB と同様、二重層を両側で固定して引き伸ばすオイル キャップの存在によるものと考えられます。

脂質二重層の存在とその機能をさらに調べるために、\(\alpha \)-溶血素 (\(\alpha \)HL) 膜貫通タンパク質を脂質二重層に挿入しました。 \(\alpha \)HL は、カルボキシフルオレセイン分子が拡散できる七量体ナノ細孔 40 です 41。 実際、内水相への \(\alpha \)HL モノマーの直接溶解は、油/水の表面張力のナノポア誘発性の変化により、擬似小胞の安定性を低下させていることを発見しました (補足情報を参照)。 したがって、主に調製され（「方法」セクションを参照）、カルボキシフルオレセインが充填された蛍光水性内相に分散された \(\alpha \)HL ナノ細孔を含む小型単層小胞 (SUV) を使用しました。 次に、前述のように擬似小胞が形成され、以前に示したように、内相に含まれる SUV が二重層と融合できるようになります 42。 この融合により、今度は機能的な膜貫通チャネルを脂質二重層 43,44 に挿入することが可能になり、我々の場合 \(\alpha \)HL になります (図 2d)。 落射蛍光顕微鏡下で、4 分ごとに 1 枚の画像を 2 時間取得することにより、擬似小胞を横切るカルボキシフルオレセインの漏出を画像化しました。 一方では \(\alpha \)HL ナノ細孔のない SUV を使用し、他方では SUV も \(\alpha \)HL も使用せずに調製した擬似小胞を使用して対照実験を実行しました。 画像解析を使用して、擬似小胞 \(I_{in}\) (それぞれ \(I_{out}\)) の内部 (または外部) の平均強度を測定し、そこから蛍光強度コントラスト \(\ガンマ = (I_{in}-I_{out})/(I_{in}+I_{out})\)。 正規化されたコントラスト\(\Gamma (t) / \Gamma (t=0)\)の時間変化を図2eに示します。 明らかに、正規化されたコントラストは、\(\alpha \)HL を含む疑似小胞では時間の経過とともに減少しますが、\(\alpha \)HL を含まない疑似小胞では一定のままです。 これは、脂質二重層が膜貫通タンパク質で機能化できることを裏付けています。 より定量的には、正規化されたコントラストを指数関数的減衰（図2eの実線）でフィッティングすると、\(5.9\pm 0.3~.10^4\) sの特徴的なリリース時間が得られます。 このタイムスケールは小胞の体積に応じて拡大すると予想されます 45。 我々の大きな小胞サイズを考慮すると、我々の結果は文献で報告されている値とよく一致しています34、45、46。

(a) アガロースゲルに捕捉された擬似小胞の複合共焦点顕微鏡画像。 内相にはカルボキシフルオレセイン (緑色) が含まれ、油相にはナイルレッド (赤色) が含まれます。 (b) 脂質混合物 (緑色) とナイルレッドを含むオイル (赤色) に 1 wt% 蛍光 NBD-PC を添加することによって得られた複合画像。 黄色 = 赤 + 緑のチャンネル。 わかりやすくするために、画像は半径 2 ピクセルのガウス フィルターで平滑化されています。 スケール バー = 200 \(\mu \)m。 (c) (b) のようにラベル付けされた N=8 個の擬似小胞にわたって平均化された、正規化された放射状蛍光強度プロファイル。 緑色の三角形 (それぞれ赤色のディスク) は、蛍光脂質チャネル (それぞれ蛍光オイル チャネル) を示します。 エラーバーはデータのSEです。 \(R=316\pm 24\) \(\mu \)m は平均擬似小胞サイズです。 (d) \(\alpha \)HL をロードした SUV を使用した、偽小胞膜への \(\alpha \)HL 挿入のスケッチ。 （ e ）正規化コントラスト\（\Gamma（t）/\Gamma（t = 0）\）、\（\alpha \）HLをロードした擬似小胞（赤いディスク、N = 5）および対照実験の時間発展\(\alpha \)HL なし (黒い四角、N=5)。 エラーバーはデータの SD です。 実線は、データ \(\Gamma (t)/\Gamma (t=0) = e^{-t/\tau } \about 1-t/\tau \) の指数近似です。タウ = 5.9\pm 0.3~.10^4 s\)。

擬似小胞はアガロースゲルのバルク内に閉じ込められているため、ゲルの表面をへこませることで擬似小胞を変形させることができます（図3a）。 電動 Z 移動ステージ (押し込み振幅、\(\Delta \)z = 1 mm) に取り付けられた四角いピストン (表面 S=1 \(\hbox {cm}^2\)) でゲルの表面を圧縮します。 、図 3b–e)、加えられた垂直抗力 F を測定します (「方法」セクション)。 蛍光マクロスコープを使用すると、カルボキシフルオレセインを含む疑似小胞が周期的に変形するので、その疑似小胞を画像化します（図3b-d）。 画像解析を使用して、楕円を擬似小胞の形状に当てはめました（解析からオイルキャップを除外しました、図3c）。 楕円の長軸 a と短軸 b の時間変化が図 3f にプロットされており、そこから楕円の離心率 \(e = \sqrt{1-b^2/a^2}\) を計算します。 離心率の変化 \(\Delta e = e(F\ne 0)-e(F=0)\) はひずみの代用として使用できます。 図3gでは、圧縮応力 \(\sigma = F/S\) を e の関数としてプロットします。 擬似小胞の実効圧縮係数 \(K_e = 12.1\pm 0.6\) kPa と線形関係 \(\sigma = K_e \Delta e\) が観察されます。 \(K_e\) の値は、ゲルの圧縮弾性率 \(K_{gel} \約 85\) kPa とは大きく異なります (図 3g の挿入図を参照)。 さらに、オイルキャップの存在が擬似小胞の変形に影響を及ぼさないことを示す補足実験（補足情報を参照）を実行しました。 したがって、私たちの方法は、脂質二重層力学または機械伝達プロセスを研究するための使いやすいプラットフォームを提供します。

(a) 機械的励起セットアップのスケッチ。 (bd) 弛緩した ((b) Z=0) または変形した (それぞれ (c,d) の Z=0.5 および 1 mm) 疑似小胞の顕微鏡蛍光画像。 (c) の赤い線は、擬似小胞の下部の輪郭を楕円に当てはめたものです。 スケール バー = 400 \(\mu \)m。 (e) ピストン位置 Z(t)。 (f) 1000 秒の長さの周期的インデントの、時間の関数としてのフィット楕円の長軸 (赤) と短軸 (青) の軸。 (g) 楕円の離心の関数としての圧縮応力 \(\sigma \) e。 灰色の十字は (f) のすべてのデータ点に対応し、黒丸は離心率 \(\delta e\)= 0.01 の範囲内の平均です。 エラーバーはデータの SD です。 赤い点線はデータへの線形近似です。 インセット: ピストンの凹みの関数としての法線力。 この線は線形フィット \(F=\kappa z\) であり、そこからゲルの圧縮係数 \(K_{gel}=\kappa H/S\) を推定できます。H はゲルの高さです。

全体として、私たちのアプローチは、ゲル内に擬似小胞を生成および捕捉するための非常に単純な方法を構成しており、セットアップが簡単で安価です。 一方で、この方法では、通常、数百マイクロリットルの溶液を必要とする通常のマイクロ流体技術21とは対照的に、少量のカプセル化相（\(\sim \) 1 \(\mu \)L のサンプル）しか必要としません。安定した流量が得られます。 一方、これは穏やかな操作に基づいているため、電鋳技術のような電場の印加によって引き起こされる可能性のあるタンパク質の変性は回避されます。 貴重でデリケートな生体サンプルの使用に特に注目されています。 ただし、我々のシステムにおける膜張力の推定値は、電鋳されたベシクルで通常報告される値よりもはるかに大きいことに注意してください。これは、おそらく二重層を両側で固定して伸ばすオイルキャップの存在によるものです。 この方法をさらに応用するには、この効果を考慮する必要があります。 最後に、擬似小胞はゲル内にトラップされているため、エマルジョンテンプレート法とは異なり、容易に局在化され、製造後の処理が必要ありません。 擬似小胞は、ゲル表面をへこませることで簡単に変形させることもでき、応力の振幅と周波数の両方を微調整することができます。 最後に、擬似小胞は、生体組織の機械的特性をよりよく模倣する粘弾性ゲルに埋め込まれます。

特に指定しない限り、すべての化学物質は Sigma Aldrich, Merk inc. から購入しました。

二重液滴の内水相には、10 mM トリス緩衝液 (pH = 7.5)、400 mM スクロース、および 100 mg/mL デキストランが含まれています (\(\hbox {M}_w\)=40.10\(^3\) g/モル、）。 蛍光擬似小胞の場合、このバッファーに 20 \(\mu \)M のカルボキシフルオレセインを追加しました。 Löser TYP6 浸透圧計で測定した内相の浸透圧は約 600 mOsm です。

外相は、10 mM Tris (pH = 7.5) および 200 mM 塩化カリウムを含む緩衝液に溶解した 3 wt% の低ゲル化温度アガロースでできています。 アガロースを添加する前に、浸透圧を 380 mosm に調整します。 次に、アガロースをホットプレート上の緩衝液に溶解し、得られた溶液を 85\(^\circ \)C で液体の状態に保ちます。

油相はヘキサデカンとシリコンオイル AR20 の 50/50 wt/wt 混合物で、乾燥脂質が溶解しています。 脂質混合物は、細菌膜組成を模倣し、液滴界面二重層幾何学的形状における安定性を最大化するために、文献４５に記載されているものである。 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン (DOPC、81.1 wt%)、1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン (DPhPC、10.8 wt%)、1,2-ジオレオイルで構成されます。 -sn-グリセロ-3-ホスホ-(1'-rac-グリセロール) (ナトリウム塩) (DOPG、5.4 wt%) およびコレステロール (2.7 wt%)。 このような高濃度の DOPC は、二重層 47,48 と油/水界面 49 の両方で脂質ドメインの形成を防止することに注意してください。 実際には、この脂質混合物 7.4 mg をクロロホルムに溶解した溶液を調製します。 次に、脂質を窒素下で乾燥させ、2 mL バイアル中で不活性雰囲気下、-20\(^\circ \)C で数週間保存します。 使用直前に油相 2 mL を加えて総脂質濃度 3.7 mg/mL にし、バイアルを 30 \(^\circ \)C の超音波浴に 30 分間入れます。 この油と脂質の混合物は数日間使用できます。

共焦点イメージングでは、油相とリン脂質を別々に標識しました。 油相は、次の手順でナイルレッドでラベル付けされます。少量の固体ナイルレッド (通常はスパチュラの先端) を 300 \(\μ \)L のアセトンに溶解します。 次いで、５ｍＬのシリコーン油をアセトン上に注ぎ、微量の溶媒をすべて蒸発させながらナイルレッド染料を油相に移すために、室温で一晩撹拌する。

脂質二重層の標識のために、上記の手順に従って蛍光脂質を脂質混合物に組み込んだ。 1-ミリストイル-2-[12-[(7-ニトロ-2-1,3-ベンゾオキサジアゾール-4-イル)アミノ]ドデカノイル]-sn-グリセロ-3-ホスホコリンまたはNBD-PC脂質を使用します。 480 nm で、ナイルレッドで標識された油相と NBD-PC で標識された脂質二重層を同時にイメージングできます。 その場合、混合物中の最終脂質濃度は、80.3wt% DOPC、10.7wt% DPhPC、2.7wt% コレステロール、5.4wt% DOPG、1wt% NBD-PC となります。

上記の脂質混合物（総脂質質量１．２５ｍｇ）を試験管内で窒素下で乾燥し、真空チャンバー内で一晩放置してさらに乾燥させる。 翌日、内水相 1 mL を脂質フィルムに添加し、溶液をプローブ超音波処理装置に 15/5 秒のオン/オフ サイクルを使用して 30 分間置きます。

\(\alpha \)HL モノマーは、内部水性緩衝液中で 250 \(\mu \)g/mL の濃度で調製されます。 \(\alpha \)HL ナノ細孔で装飾された SUV を得るために、この \(\alpha \)HL 溶液 30 \(\mu \)L を 120 \(\mu \)L の SUV 溶液に加えました。最終細孔モノマー濃度は 50 \(\mu \)g/mL になります。 得られた混合物を室温で約 1 時間インキュベートし、擬小胞の内相として使用します。

油相/水相サンドイッチは、本文に記載されている手順に従って作成されます。 温かいアガロース溶液を分光光度計のキュベット (寸法 10x10x40 \(\hbox {mm}^{3}\)) に注ぎます。 アガロースの温度は、温度熱電対（USB-TC01、National Instrument）を使用して測定されます。 温度が約 38 °C に達すると、二重液滴が形成されます。 このシステムを約 15 分間放置して室温まで冷却すると、アガロースが擬似小胞の周囲でゲル化します。 この方法は原則として液体（アガロースを含まない）環境でも使用でき、これにより、22、23、24 で説明されているオイルキャップ除去技術の使用が可能になることに注意してください。 しかし、私たちの最初の試験では、生成された液滴（大きく、外相よりもかなり密度が高い）の高い沈降速度により、形成中に疑似小胞が不安定になりました。 擬似ベシクルのサイズを小さくする（より小さい注入チップ直径を使用する）、内相の密度を調整する、または外相の粘度を高めると、生成される二重液滴の沈降速度が低下し、安定した擬似ベシクルを得る有望な方法のように思えます。液体環境では。

アガロースにおける機械的励起実験では、液体アガロースを注ぐ前に、プレキシグラスの薄い長方形のシート (幅 1 mm) をキュベットの片側に追加して壁を覆います。 アガロースがゲル化するので、このシートを注意深く取り除き、アガロースゲルとキュベットの壁の間に空のスペースを残します。 実際、ポアソン効果により、ゲルが垂直方向に圧縮されると、ゲルの横方向の膨張が発生します。 この空のスペースは、この横方向の拡張とゲルの適切な弾性変形を可能にするために必要です。

キュベットは、図 3a に示されているデバイス上に配置され、固定されます。 ピストンはキュベットのサイズに合わせて 3D プリントされており、薄いプレキシガラス シートがピストンの表面に接着されてアガロース表面を凹ませています。 ピストンは、Newport LTA-HL リニア アクチュエータ (Z 解像度 1 \(\mu \)m) によって制御される並進ステージに取り付けられています。 ピストンがゲルをへこませると、サンプルホルダーのベースに取り付けられた 2 つの平面カンチレバーのセットが偏向します。 静電容量センサーがカンチレバーのたわみを測定します。 これらのカンチレバーの剛性が（以前のキャリブレーションから）わかっているので、加えられた垂直抗力 F を推定します（F の測定ノイズは 1 mN です）。

押し込み実験の最初のステップは、ゲル表面の位置を決定することから成ります。 この目的を達成するために、垂直抗力を測定しながら、ピストンの Z 位置を 0.1 mm ずつ下げます。 力が 5 mN に達すると、ランプは停止し、この Z 位置が Z 座標の原点となります。

次に、この表面位置から値 \(\Delta Z\) だけ 100 \(\mu \)m ずつゲルを凹ませることで、ゲルに周期的な変形を加えます。 各ステップで力が測定されます。 偽小胞は、Leica マクロスコープと Pointgrey カメラ (BFLY-U3-23S6C-C) を使用して、各凹みステップで画像化されます (青色光のパルス、持続時間 500 ミリ秒を使用)。

より小さい擬似小胞サイズを達成するために、より小さい注入チップを使用します。 実際には、外径 240 \(\mu \)m、内径 130 \(\mu \)m のポリウレタン チューブ (Phymep) を使用します。 このチューブは、自家製のマイクロインジェクターに取り付けられた 50 \(\mu \)L シリンジ (Hamilton) に接続されています。 疑似小胞は、蛍光内部バッファーを使用してアガロースゲル内で生成され、落射蛍光によって画像化されます。 画像解析を使用してそれらのサイズを決定し、平均直径 \(D= 410 \pm 45 \mu \)m (N=6) を求めます。 原理的には、より小さい注入チップを使用すると、より小さいサイズを得ることができます。 唯一の実験上の困難は、油と水のサンドイッチを形成することです。 市販のマイクロインジェクターの使用が必要になります。

この研究中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開された論文とその補足情報ファイルに含まれています。 生データおよび資料に関する通信およびリクエストは、EW または L.-LP に宛ててください。

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著者らは、SUV の準備に関して貴重なご協力をいただいた Mathieu Letrou 氏と Sophie Cribier 氏に感謝します。 EW はエマージェンス ソルボンヌ大学からの財政的支援を認め、LLP は国立研究機関 (BOAT、ANR-17-CE30-0001) およびエマージェンス ヴィル ド パリからの支援を認めます。

ソルボンヌ大学、CNRS、パリ・セーヌ生物学研究所 (IBPS)、ジャン・ペラン研究所 (LJP)、4 place Jussieu, 75005, Paris, France

ピエール・タピエ、アレクシス・M・プレヴォスト、ロレーヌ・モンテル、レア＝レティシア・ポンターニ、エリー・ワンダースマン

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EW と LLP はプロジェクトと実験を考案し、結果を分析し、論文を執筆しました。PT は実験データを収集し、結果を分析し、原稿をレビューしました。 LM は実験データの収集に参加し、結果を分析し、原稿をレビューしました。 AP は実験装置の開発に参加し、結果を分析し、原稿をレビューしました。

レア・レティシア・ポンターニまたはエリー・ワンダースマンとの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Tapie、P.、Prevost、AM、Montel、L. 他。 ゲル内にベシクルを作成、捕捉、変形させる簡単な方法です。 Sci Rep 13、5375 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-31996-9

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受信日: 2022 年 7 月 13 日

受理日: 2023 年 3 月 21 日

公開日: 2023 年 4 月 2 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-31996-9

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