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Oct 26, 2023

インデューサー

Rapporti scientifici Volume 12,

Scientific Reports volume 12、記事番号: 19445 (2022) この記事を引用

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メトリクスの詳細

トリコデルマ リーセイは、リグノセルロース系バイオマス分解用のセルラーゼおよびヘミセルラーゼ カクテルを生成するために広く使用されている宿主です。 今回我々は、セルロース、ラクトース、ソホロースなどの誘導物質を使用せずに、単純なグルコースを使用して酵素生産を可能にする工業用T. reeseiの遺伝子組み換え戦略を報告します。 これまで、変異型XYR1V821FやXYR1A824Vはグルコースのみを炭素源としてキシラナーゼやセルラーゼを誘導することが知られていたが、酵素組成がキシラナーゼに偏っており、リグノセルロースを効率よく分解するには性能が不十分であった。 したがって、酵素の生産性と発現を向上させるために高度に変異誘発された T. reesei E1AB1 株に対する、セルラーゼ制御因子およびセルラーゼ発現に必須の因子として知られる、変異 XYR1V821F と構成的に発現する CRT1、BGLR、VIB1、ACE2、または ACE3 の組み合わせを検討しました。高い酵素パフォーマンスを実現するβ-グルコシダーゼ。 その結果、変異型XYR1V821F発現株に対するACE3の発現によりセルラーゼ発現が促進されることが示された。 さらに、これら 2 つの転写因子を共発現させると生産性も向上し、従来の変異型 XYR1V821F の単独発現よりも酵素生産性が 1.5 倍高くなりました。 さらに、その生産性は、ACE3 の単一発現を強化した場合の生産性と比較して 5.5 倍高かった。 さらに、ACE3のDNA結合ドメインはインデューサーフリーのセルラーゼ生産に必須であると考えられていたが、部分的に切断されたDNA結合ドメインを持つACE3は、変異したXYR1V821Fと共発現させるとセルラーゼ生産においてより効果的であることがわかった。 この研究は、2 つの転写因子、変異 XYR1V821F または XYR1A824V と ACE3 の共発現により、酵素組成が最適化され、生産性が向上することを示しています。

化石燃料を環境に優しい再生可能エネルギー源に置き換えることは、持続可能な社会を構築するために不可欠です。 リグノセルロース系バイオマスは、バイオリファイナリーおよびバイオ燃料生産のための最も豊富な持続可能な原料です。 したがって、リグノセルロース系バイオマスを効果的に利用することは、問題の解決に役立つ可能性があります1,2。

リグノセルロース系バイオマスを原料として利用するには、セルラーゼやヘミセルラーゼを用いてリグノセルロース系バイオマスを単糖に加水分解する必要がある。 リグノセルロース系バイオマス分解のための細胞外セルラーゼおよびヘミセルラーゼは、主に糸状菌によって産生されます3。 特に糸状菌のトリコデルマ リーセイ (テレオモーフ ハイポクレア ジェコルナ) は、リグノセルロース系バイオマスの分解のために大量の混合細胞外セルラーゼ酵素とヘミセルラーゼ酵素を生産するよく知られた微生物です 4,5。 T. リーゼイの工業用株を使用して最大 80 g/L 以上の細胞外タンパク質を得ることができるという報告を考慮すると、セルラーゼは商業的セルラーゼ生産の主力となることが期待されています 4,6,7,8。 それにもかかわらず、リグノセルロース系バイオマスの酵素加水分解には大量のリグノセルロース分解酵素が必要であり、酵素の高コストがリグノセルロース系バイオ燃料の生産における主要なボトルネックとして認識されている9、10、11、12。

最良の解決策の 1 つは、酵素生産能力を強化し、グルコースなどの安価な炭素源を使用することです。 したがって、セルラーゼ発現の制御機構をよく理解する必要があります。 ただし、セルラーゼの発現はいくつかの転写因子 (TF) によって複雑に制御されており、セルラーゼ遺伝子の発現に直接的または間接的に影響を与える可能性があります 13。 したがって、さまざまな要因の具体的な役割とその完全な制御ネットワークはまだ完全には理解されていません。 これまでの研究では、さまざまなセルラーゼ調節因子の役割が実証されています。 XYR1、HAP2/3/5、ACE2、VEL1、ACE3、ARE1、CRZ1、STR1、および VIB1 は正の制御因子ですが、CRE1、ACE1、RCE1、CTF1、LAE1、および PAC1 は負の制御因子として特定されています 14,15。 セルラーゼ遺伝子の発現には炭素異化産物抑制 (CCR) の解除が必要です16。 そこで、セルラーゼ制御因子を遺伝子技術により改変することが有効であると考えられる。

転写リプレッサー CRE1 は CCR の重要な調節因子であり、グルコースの存在下で糸状菌のセルラーゼ発現を間接的に阻害することが知られています 16。 トリコデルマでは、cre1 の切断 17、欠失 18、または多部位特異的突然変異誘発 19 により CCR が軽減されます。 したがって、グルコース、ラクトース、ソホロース、セルロースなどのさまざまな炭素源の存在下でセルラーゼ遺伝子の発現を顕著に増強することが可能です20、21、22、23。 特に、CRE1変異株をグルコース含有培地で培養すると、cre1の欠失または切断によりセルラーゼおよびヘミセルラーゼの部分的な抑制解除が引き起こされます16、17、18、24。 しかし、糖類を誘導せずにグルコースのみを含む培地では、CRE1変異株はCCRを完全に遊離することができない。 したがって、セルラーゼまたはヘミセルラーゼの発現を抑制するか、抑制も活性化も行わないため、セルラーゼの生産が低下します。 さらに、セルラーゼ遺伝子の発現レベルを向上させるためにリプレッサー ace125 と rce126、および cre1 を削除することもできますが、発現にはインデューサーが必要であると考えられています。

対照的に、ほとんどのセルラーゼおよびヘミセルラーゼ遺伝子の発現に必要な正の制御因子である XYR1 は、修飾によって誘導物質なしでこれらの遺伝子を発現できる可能性をもたらしました。 XYR1 は Zn(II)2Cys6 型 DNA 結合ドメインを持ち、セルラーゼ/ヘミセルラーゼ遺伝子の上流領域に直接結合します 27,28。 xyr1 の破壊はセルラーゼ陰性表現型をもたらし 29 、これはセルラーゼ誘導に必須の因子であることを示しています。 XYR1 は、構成的過剰発現の条件下でセルラーゼ遺伝子発現の増加を促進しますが、唯一の炭素源としてグルコースを含む培地中でのセルラーゼ生産は増加しません 12。 セルラーゼ発現を増加させるために、TF の操作も実施されています。 XYR1 と他の転写因子を融合する人工 TF が開発され、唯一の炭素源としてグルコースを使用してセルラーゼを構成的に生産することが試みられているにもかかわらず、タンパク質の生産性は誘導生産につながっていません 30,31。 変異した XYR1V821F または XYR1A824V を発現する株は、唯一の炭素源であるグルコース中でもキシラナーゼとセルラーゼを発現し、タンパク質生産性を向上させました 8,32,33。 それにもかかわらず、変異型 XYR1V821F または XYR1A824V によって誘導される酵素は、キシラナーゼ組成が高く、セルラーゼ組成が低いため、リグノセルロースの効率的な分解には十分ではありませんでした 32,33。 そこで、グルコースを唯一の炭素源とする培地でもセルラーゼ・ヘミセルラーゼを誘導状態と同様のレベルで生産するには、XYR1と協働してセルラーゼの発現を活性化する因子を添加する必要があると考え、協調因子の探索を行った。変異した XYR1V821F で発現します。

転写活性化因子 ACE234、ACE335、および VIB136 は、推定上の協力因子でした。 さらに、xyr1 遺伝子発現の制御に関与するセルロース応答性トランスポーターである CRT137,38 と、β-グルコシダーゼ活性化因子である BGLR39 がそれとして考えられました。

ACE2 は、セルロース誘導により T. reesei における cbh1、cbh2、egl1、egl2、および xyn2 の転写活性化を増強する転写因子です 34。 ただし、ACE2 はソホロース誘導には関与しません。 ACE2 は XYR1 と共有される同じプロモーター モチーフに結合し、リン酸化と二量体化は ACE2 がその標的プロモーターに結合するための前提条件です 40。

T. reesei では、ACE3 はラクトースによる誘導時のセルラーゼ生成に関与することが知られています 35。 ACE3 は XYR1 と相互作用してセルラーゼ生成を開始します 41。 ace3 の複数の遺伝子コピーの導入により、セルラーゼ遺伝子の発現が増強され、キシラナーゼ遺伝子の発現が制御されます 35。 さらに、C 末端切断型 ACE3 は、グルコースを使用した非誘導条件で高レベルのセルラーゼおよびヘミセルラーゼの発現を誘導し、乳糖またはグルコース-ソホロス混合物を使用した誘導条件での発現をさらに向上させることができます 42,43。 誘導剤の存在下でも非存在下でも、セルラーゼの誘導が改善されたことが示されています。 さらに、野生型 XYR1 または変異型 XYR1A824V および C 末端切断型 ACE3 を過剰発現する株は、炭素源として乳糖を使用した総分泌タンパク質を向上させました。 しかし、グルコースを唯一の炭素源として使用した場合、C 末端切断型 ACE3 に加えて変異 XYR1A824V をさらに過剰発現しても、さらなる改善はもたらされませんでした 42。

T. リーゼイでは、VIB1 もセルラーゼ生産に必須であり、セルラーゼ誘導の重要な調節因子として機能します 36,44。 セルロースを炭素源として使用したΔvib1 トランスクリプトームとΔxyr1 トランスクリプトームの比較では、VIB1 ターゲットと XYR1 ターゲットによって制御されるセルロース誘導性遺伝子間の重複が高い頻度で示されました 45。 これは、VIB1 が XYR145 を介してセルラーゼ遺伝子発現を部分的に調節していることを示唆しています。

CRT1 は、T. reesei におけるセルラーゼ誘導に関与する最も重要なトランスポーターの 1 つであると考えられています 37,38。 その欠失により、セルロースとラクトースによる誘導時にセルラーゼ遺伝子発現が完全に消失することが判明しました38。 最近、CRT1 がラクトース、セロビオース、グルコース、ソポロスを輸送することが検証されました 46。 さらに、グルコース含有条件下で XYR1 が過剰発現すると、crt1 転写は比較的低いレベルに維持されました 47。

BGLR は β-グルコシダーゼ活性化因子であり、Zn(II)2-Cys6 型 DNA 結合ドメインを持つ転写因子です 39。 BGLR の機能の 1 つは、特定の β-グルコシダーゼ遺伝子を上方制御することです 39。 bglr 遺伝子欠失変異体は、セロビオースの増殖中にセルラーゼ生産の増加を示しました。

我々は、変異した XYR1V821F とそれに関連すると報告されている 5 つの因子のそれぞれが、グルコースを炭素源として使用する誘導物質のない条件下でのセルラーゼおよびヘミセルラーゼの生産の調節に影響を与えるかどうかを調べました。

我々は、生産性が高く、グルコースの CCR が軽減される傾向がある T. reesei の高性能酵素生産株である PC-3-7 の派生株を使用しました 48,49,50。 T. リーゼイは、セルロース、セロビオース、ソホロースなどの誘導物質とともに培養すると、完全なセルラーゼ セットを分泌することが知られています 5,51。 対照的に、T. reesei の CBH および EG 活性は他の微生物よりも高いことが知られていますが、その BGL 活性は他の微生物のセルラーゼ混合物の活性よりも低いことが知られています 52。 これにより、セロビオースの蓄積とその後の CBH 生成物の阻害が生じ、酵素加水分解効率が低下します。 この問題を解決するには、酵素の性能を向上させるためにBGLの添加が有効です。 T. reesei で BGL を過剰発現させることにより、生産コストを下げることができます。 E1AB1 株は、PC-3-7 株の Aspergillus aculeatus (Aabgl) 由来の β-グルコシダーゼ遺伝子を有しています52,53,54。

私たちは、より実用的な酵素生産株としてE1AB1を用いてセルラーゼ生産に誘導剤を必要としない株の開発を目指しました。 我々は、候補5因子と非誘導条件下で高レベルのキシラナーゼ産生を誘導する変異型XYR1V821Fを共発現させることによりセルラーゼの発現を試みた。 この研究では、セルラーゼ誘導が不十分であるという欠陥が、変異した XYR1V821F と ACE3 の構成的発現によって解消されました。 したがって、セルラーゼ誘導剤を使用せずに糖化酵素の安価な生産が達成できることを報告します。

変異型 XYR1V821F とその候補協調因子の発現を組み合わせるために、変異型 XYR1V821F と各因子を発現させるために 2 つのゲノム挿入部位が必要でした。 したがって、転写抑制因子をコードする ace1 および rce1 遺伝子領域を挿入部位として使用しました。

まず、欠失の影響を確認するために、ace1 および rce1 リプレッサー遺伝子の破壊を実行しました。 その結果、E1AB1株、Δace1株、Δrce1株のタンパク質生産性は、親株E1AB1株の炭素源としてセルロースを用いた誘導条件と比較して、炭素源としてグルコースを用いた非誘導条件下では10%未満に低下したことが示されました（図1）。 .1a)。 さらに、図1bに示すように、ace1またはrce1の破壊は分泌タンパク質の組成を変化させませんでした。 白矢印で示された高強度のバンドが見つかり（図1b、レーン2〜4）、ナノLC-MS/MS分析によってグリコシドヒドロラーゼファミリー55（GH55）タンパク質（Trire2_121746）として同定されました。 このタンパク質は、Phanerochaete chrysosporium の β-1,3-グルカナーゼ Lam55A に類似していることが判明しました (追加ファイル表 S1)。 これは、グルコースを唯一の炭素源とした 3 つの株ではセルラーゼ生成がほとんど観察されなかったことを示しています。

V821F 変異 XYR1 の構成的発現とリプレッサーの破壊がグルコース培養に及ぼす影響。 (a) 72、96、および 120 時間後のサンプルの培養からの細胞外タンパク質。 トリコデルマ リーセイ株 E1AB1 は、3% セルロースを含む誘導培地で振盪フラスコ内で培養し、組換え株 E1AB1Δace1、E1AB1Δrce1、E1AB1-X (Δace1-Pact1-xyr1V821F)、および E1AB1-XΔrce1 は、3% セルロースを含む非誘導培地で培養しました。 % グルコース。 (b) 72 時間後の分泌タンパク質の SDS-PAGE 分析。 3% セルロース (レーン 1) および 3% グルコース (レーン 2) 培養物を含む T. リーゼイ株 E1AB1、および組換え株 E1AB1Δace1 (レーン 3)、E1AB1Δrce1 (レーン 4)、E1AB1-X (レーン 5)、および E1AB1-XΔrce1 (レーン 6) 3% グルコース培養。 白矢印はグルコース培養で確認されたものを示します (レーン 2 ～ 4)。 黒矢印は明らかに過剰発現したタンパク質を示し、おそらく主要なキシラナーゼに対応します (BXL1、XYN1、XYN2、レーン 5 および 6)。 ゲルは 15 ～ 250 kDa の範囲で切り取られ、元のゲルは追加ファイルの図 S4 に示されています。 エラーバーは標準偏差を示します。 統計的有意性は、対応のない両側スチューデント t 検定によって決定されました。 **p < 0.01。

E1AB1株のセルロースおよびグルコースを含む培養条件下で得られたRNAseq結果において、ピルビン酸デカルボキシラーゼ1（Trire2_121534）と同様の発現レベルを示した、炭素源利用の影響を受けない構成的プロモーターとしてact1プロモーターを選択しました54。 構成的に活性なact1プロモーター下にあるXYR1V821Fを有するカセットをace1遺伝子座に導入し、この株をE1AB1-Xと命名した。 E1AB1-X 株は、非誘導条件下で 2.08 g/L の細胞外タンパク質を生成しました。 これは、親株と比較して細胞外タンパク質産生の4倍の増加でした（図1a）。 さらに、SDS-PAGE分析ではバンドパターンの違いが観察されました（図1b、黒矢印）。 推定分子量と以前の報告 53 に基づいて、タンパク質バンドは主要なキシラナーゼ (XYN1、XYN2) および β-キシロシダーゼ (BXL1; 図 1b、レーン 5) に対応すると考えられます。 しかし、それらの組成は、誘導条件で親株E1AB1によって産生されるタンパク質の組成とは異なり（図1b、レーン1および5）、セルラーゼ（CBH1、CBH2、EG1）に対応するバンド強度も低かった。

したがって、キシラナーゼは、誘導物質を含まない条件下でも、変異した XYR1V821F の構成的発現によって生成される可能性があります。 しかし、セルラーゼは完全には生成されませんでした。 E1AB1-X株でさらにrce1遺伝子を破壊すると、タンパク質生産性が増加しましたが（図1a）、酵素組成には大きな変化はありませんでした（図1b、レーン6）。 したがって、rce1 遺伝子座を使用して、セルラーゼ生産のための候補協調因子を共発現することによるセルラーゼ生産性の向上をテストしました。

crt1、bglr、vib1、ace2、およびace3、セルラーゼ活性化因子、およびセルラーゼ発現に必須の因子の相同組換えがE1AB1-Xゲノムのrce1遺伝子座で行われ、続いてact1プロモーター下で構成的発現が行われました。 E1AB1-X株におけるCRT1、BGLR、VIB1、またはACE2の構成的共発現では、分泌タンパク質濃度（図2a）およびCBH1、CBH2などのセルラーゼに対応する分子量のバンド（図2a）に大きな変化は見られませんでした。 .2b、レーン 2 ～ 5)。 対照的に、ACE3を構成的に発現する株E1AB1-XA3は、E1AB1-Xと比較してタンパク質産生の1.5倍の増加を示しました（図2a）。 酵素組成分析により、E1AB1-XA3の黒矢印で示されるように、キシラナーゼ（XYN1、XYN2、およびBXL1）に対応するバンドの減少と、強度が増加したいくつかのバンドが明らかになりました（図2b、レーン6）。 ナノ LC-MS/MS 分析によって特定されたこれらのバンドは、主にセルラーゼ (CBH1、CBH2、および EG1)、キシラナーゼ (BXL1 および XYN4)、およびセルロースの分解に関与する少量のタンパク質 (SWO1、CIP2、および EG4) でした。 (追加ファイル テーブル S2)。

E1AB1-X株におけるセルラーゼ転写に関与する因子の共発現。 トリコデルマ リーゼイ E1AB1-X 株をセルラーゼ発現に関連するさまざまな因子と共発現させ、振盪フラスコ内で 3% グルコースを含む非誘導培地で培養しました。 (a) 96 時間後の培養サンプルからの細胞外タンパク質。 （ b ）T. reeseiのグルコース培養で72時間後の分泌タンパク質のSDS-PAGE分析 E1AB1-X（レーン1、Δace1-Pact1-xyr1V821F、対照として）、E1AB1-XC（レーン2、Δace1-Pact1- Xyr1V821FおよびΔRCE1-PACT1-CRT1）、E1AB1-XB（レーン3、ΔACE1-PACT1-XYR1V821FおよびΔRCE1-PACT1-BGLR）、E1AB1-XV（LANE 4、ΔACE1-PACT1-XYR1V821FおよびΔRCE1-PACT1-VIB1） -XA2 (レーン 5、Δace1-Pact1-xyr1V821F および Δrce1-Pact1-ace2)、および E1AB1-XA3 (レーン 6、E1AB1-XA3、Δace1-Pact1-xyr1V821F およびΔrce1-Pact1-ace3(PT))。 ゲルは 15 ～ 250 kDa の範囲で切り取られ、元のゲルは追加ファイルの図 S5 に示されています。 (c) 72 時間培養上清の酵素活性の容積測定。 活性の 1 単位は、50 °C で基質から培養上清 1 mL あたり 1 分間に 1 μmol の p-ニトロフェノールを生成する酵素の量として定義されます。 棒グラフは、E1AB1-X の活性と比較した活性を示します。 エラーバーは標準偏差を示します。 統計的有意性は、対応のない両側スチューデント t 検定によって決定されました。 **p < 0.01。

ACE3恒常的共発現株の培養上清の酵素活性を測定するために、CBH1活性についてはpNPLaseを、BGL活性についてはpNPGaseを測定した。 その結果、E1AB1-XA3株は、E1AB1-X株と比較して、pNPLaseにおいて4.9倍、pNPGaseにおいて5.5倍高いことが示された。 E1AB1 株では、A. aculeatus 由来の β-グルコシダーゼ (Aabgl1) が egl1 プロモーターを使用して発現されます。 pNPGase 活性の増加は、E1AB1-XA3 株における egl1 プロモーターの転写の増強を示唆しています。 セルラーゼ活性を示すこれらの pNPGase および pNPLase 活性値は、約 5 倍に増加しました。 一方、キシラナーゼ活性を示すpNPXaseおよびpNPX2ase活性値は、最大1.8倍および0.8倍に変化しました。 セルラーゼとは異なり、キシラナーゼ活性があまり改善されなかったという事実は、ACE3 がセルラーゼ発現の特異的な改善に寄与していることを示唆しています。

さらに、非誘導条件下で観察されたGH55のバンド（図1b、白抜き矢印のレーン2〜4）は、ACE3を構成的に発現している株の上清では消失しました。 Lam55A は β-1,3-グルカンを加水分解し、外部栄養源の代謝を調節する可能性があります 55。 したがって、E1AB1-XA3株では誘導物質の非存在下でもセルラーゼが誘導されており、セルラーゼ生産が活発に誘導されている状態に類似していると推測された。 その結果、変異型XYR1V821FとACE3の構成的発現を組み合わせたE1AB1-XA3株は、誘導物質を含まない条件下でもキシラナーゼと高収率のセルラーゼの生産を可能にすることを見出した。

E1AB1-XA3株は誘導物質の非存在下でも高いセルラーゼ生産性を有しており、ACE3と変異XYR1V821Fの組み合わせがセルラーゼ活性の上昇に有効であることが示された（図２）。 V821F 変異に加えて、A824V 変異は、誘導物質なしでキシラナーゼおよびセルラーゼの発現を可能にする XYR1 変異の 1 つであることが以前に報告されています 32。 したがって、潜在的に有用なXYR1変異体を確認するために、グルコースブラインド表現型を持つV821FおよびA824V変異体を野生型とともに評価しました（図3a）。 対照的に、ace341,43 には複数の転写開始点が存在する可能性があることが報告されています。 図 2 で使用されている E1AB1-XA3 の ace3 は、JGI ゲノム データベース (http://genome.jgi.doe.gov/Trire2/Trire2.home.html に示されている ORF 配列 (651 または 629 アミノ酸)) に由来しています。 ）参照により。 ただし、正しいイントロンと 2 つの推定転写開始部位が提案されました 41,43。 推定された完全なアミノ酸配列は734アミノ酸であり、JGIに登録された配列は部分的に切断されたN末端DNA結合ドメインであった。 したがって、ゲノム DNA から両方の推定翻訳開始部位をクローニングし、部分的に切断された ACE3 (PT-ACE3) と完全長 ACE3 (FL-ACE3) の構成的発現を調べました (詳細は追加ファイルの図 S1 に記載されています)。 さらに、非相同組換えを使用して XYR1 と ACE3 の構成的発現を実行し、2 つのリプレッサー (ace1 と rce1) の破壊が必須であるかどうかを調べました。 この研究で使用された株、炭素源、および遺伝子型は、追加ファイルの表 S3 にリストされています。

インデューサーフリー条件下でのセルラーゼの高生産に必要な遺伝子の組み合わせの確認。 (a) 研究で使用された XYR1 および ACE3 の推定ドメイン、XYR1 のアミノ酸変異、および ACE3 の推定変異体。 振盪フラスコ培養は、3% セルロース: レーン 1 および 3% グルコース: レーン 2 ～ 9 を使用して実行されました。 この図で使用した株は、レーン 1 および 2: E1AB1、レーン 3: E1AB1-X (Δace1-Pact1-xyr1V821F)、レーン 4: E1AB1-A3 (Δrce1-Pact1-ace3(PT))、レーン 5: E1AB1- XA3 (Δace1-Pact1-xyr1V821F および Δrce1-Pact1-ace3(PT))、レーン 6: E1AB1-XA3fl (Δace1-Pact1-xyr1V821F および Δrce1-Pact1-ace3(FL))、レーン 7: E1AB1-XA3nhr (Pact1- xyr1V821F および Pact1-ace3(PT) (非相同組換えによる)、レーン 8: E1AB1-X824A3nhr (Pact1-xyr1A824V および Pact1-ace3(PT) 非相同組換えによる)、レーン 9: E1AB1-XwtA3nhr (Pact1-xyr1WT およびこの図で使用される炭素源、株、および遺伝子型は、追加ファイルの表 S3 にまとめられています。 (b) 72 時間培養後の分泌タンパク質の SDS-PAGE (2.5 μg タンパク質/レーン)。 ゲルは 15 ～ 250 kDa の範囲で切り取られ、元のゲルは追加ファイルの図 S6 に示されています。 (c) 96 時間後の細胞外タンパク質濃度。 xyr1 (d) および ace3 (e) の相対転写レベル。 48 時間後に採取したサンプルに対してリアルタイム PCR を実行しました。 グルコース培養上の pgk1 株と E1AB1 株の転写レベルをそれぞれ参照計算とデータ正規化のために測定し、ΔΔCt 法を使用して分析しました。 エラーバーは標準偏差を示します。 統計的有意性は、対応のない両側スチューデント t 検定によって決定されました。 **a はレーン 5 (E1AB1-XA3) でのテストで p < 0.01 を示し、**b はレーン 7 (E1AB1-XA3nhr) でのテストで p < 0.01 を示しました。

ACE3を構成的に発現するすべての株において、分泌タンパク質の酵素組成は主にセルラーゼでした（図3b、レーン4、5、6、7、8、および9）。 PT-ACE3を発現するE1AB1-A3株（図3c、レーン4）およびACE3と野生型XYR1を共発現するE1AB1-XwtA3株（図3c、レーン9）の総タンパク質生産量は0.57 g/Lでした。それぞれ0.51 g/L。 これらの結果は、ACE3 と変異 XYR1V821F の共発現が高生産性に有効であることを示しました。 組み合わせる変異XYR1はV821F特異的である必要はないが、少なくとも変異XYR1V821FまたはXYR1A824Vのようなグルコースブラインド表現型を示す必要がある（図3b、c、レーン7および8）。 さらに、ACE3の共発現は部分切断配列と全長配列で効果的であり、どちらもセルラーゼ主体の組成を持ち、XYR1V821Fの単一発現よりも高い生産性を示しました（図3b、c、レーン6）。 しかしながら、FL-ACE3を有するE1AB1-XA3fl株の生産性は、PT-ACE3を有するE1AB1-XA3株の生産性よりも14%低かった(図3c、レーン5)。 部分的に切断された DNA 結合ドメインを持つ ACE3 は優れた生産性を持っていたため、この結果は驚くべきことでした。 非相同組換えによる変異XYR1V821FおよびACE3の発現(図3c、レーン7、E1AB1-XA3nhr株)は、上記と同じ共発現効果を示した。 しかし、タンパク質生産性はace1よりも低く、rce1はE1AB1-XA3株を破壊しました（図3c、レーン5）。

xyr1 と ace3 の転写レベルは、表 S3 にリストされている 9 株で比較されました。 総 xyr1 転写産物は、非変異領域のプライマー ペアを使用して測定され、特に変異位置でリバース プライマーを設計することによって、WT、V821F、および A824V について測定されました。 ace3 転写物の測定に使用されるプライマーは、すべての ace3 の共通配列に対して、および全長 (エクソン 2) または部分的に切断された (イントロン 2 からエクソン 3 内) の固有の配列に対して設計されました (追加ファイル表 S4)。 したがって、炭素源としてグルコースを含む培地中で、親E1AB1株と比較して、変異XYR1V821Fを恒常的に発現するE1AB1-X株では、xyr1転写レベルが11.5倍増加した。 増加は、xyr1V821Fだけでなく、xyr1WT（ネイティブxyr1）でも4.2倍でした（図3d、レーン2および3）。 さらに、ace3発現が直接的に増強されなかったにもかかわらず、総ace3転写はE1AB1-X株で6.2倍増加した（図3e）。 これは、天然の xyr1 および ace3 の発現が、変異 XYR1V821F によって直接的または間接的に大幅に増強されることを示しています。 さらに、変異したxyr1V821FとPT-ace3を共発現するE1AB1-XA3株では、xyr1とace3の総転写レベルは、親株と比較してそれぞれ最大16.8倍と8.9倍に増加しました（図3d、e、レーン5） ）。 変異型xyr1を利用せずにxyr1WTとPT-ace3を共発現させた場合（E1AB1-XwtA3nhr株）、xyr1とace3の総転写レベルは6.7倍（図3d、レーン9）および3.7倍（図3d、レーン9）増加した。 3e、レーン9)。 しかし、総分泌タンパク質レベルは増加しませんでした (図 3c、レーン 9)。 これらの結果は、高いセルラーゼ生産には一定レベルの総 XYR1 または変異 XYR1 (変異 XYR1V821F または XYR1A824V など) が必要であることを示唆しました。

これらの結果は、誘導因子の非存在下での高いセルラーゼ生産には、グルコースブラインド表現型（V821F、A824Vなど）およびACE3（全長および部分切断型）を示す変異XYR1の構成的発現が必要であることも示した。 さらに、ACE3 の DNA 結合ドメインの部分的な切断と ace1 および rce1 の破壊が高いタンパク質生産性に寄与しており、E1AB1-XA3 株の遺伝子型がこの研究で最も効果的な組み合わせであることが判明しました。

XYR1V821F単独発現（E1AB1-X株）、PT-ACE3単独発現（E1AB1-A3株）、XYR1V821FとPT-ACE3共発現（E1AB1株）におけるセルラーゼとキシラナーゼの遺伝子発現と活性を解析した。 -XA3株）。

XYR1V821F変異の影響により、E1AB1-X株における主要なセルラーゼの転写は、親株E1AB1の転写よりも約4桁高かった（図4a）。 さらに、E1AB1-XA3株では、PT-ACE3の構成的発現により、E1AB1-X株と比較してセルラーゼ転写レベルがさらに6.4倍増加しました（図4a）。 主要なキシラナーゼである xyn1 および xyn2 の発現増加は最大 1.7 倍であり (図 4a)、これはそれらの酵素活性と一致していました (図 4b)。 これらの結果と一致して、E1AB1-XA3株によって産生される酵素は、E1AB1-X株と比較して、同様の量のキシラナーゼおよびセルラーゼ（CBH1、CBH2、EG1）成分の特異的な増加を示しました（図4c）。 グルコースを使用した非誘導培養物におけるE1AB1-XA3株のセルラーゼ/キシラナーゼ組成は、セルロースを使用した親E1AB1株の誘導培養物と同様でした（図4b、追加ファイル図S2）。 E1AB1-A3株では、pNPX2aseとpNPXaseの分解活性はほとんど検出されず（図4b）、BXL1、XYN1、XYN2のバンドはほとんど確認できませんでした（図3b、レーンNo.4）。 したがって、ACE3の構成的単一発現はセルラーゼ産生を活性化できますが、キシラナーゼ産生を完全に活性化することはできませんでした（図3c）。 さらに、SDS-PAGE から推定したタンパク質濃度および組成に基づいて、CBH1、CBH2、および EG1 の絶対量は、E1AB1-X、-A3、および -XA3 株でそれぞれ 0.24、0.34、および 1.25 g/L でした。 これは、変異したXYR1V821FとACE3の共発現時のセルラーゼの相乗的な上方制御を裏付けています（図4c）。

微結晶セルロースの遺伝子発現、酵素活性、組成、糖化の解析。 (a) 主要なセルラーゼおよびキシラナーゼの相対的な遺伝子発現。 炭素源としてグルコースを使用して、48 時間培養サンプルに対してリアルタイム PCR を実行しました。 pgk1 および E1AB1-X 株 RNA の転写レベルをそれぞれ参照計算およびデータ正規化のために測定し、ΔΔCt 法を使用して分析しました。 (b) 炭素源としてグルコースを使用して 72 時間培養した後に得られた培養上清中の各酵素の体積活性。 活性の 1 単位は、50 °C で基質から培養上清 mL あたり 1 分あたり 1 μmol の p-ニトロフェノールを生成する酵素の量として定義されます。 棒グラフは、E1AB1-X に対する相対的な活性を示します。 (c)酵素組成と総分泌タンパク質濃度から各酵素成分の濃度を算出した。 組成は、E1AB1（セルロース：C、グルコース：Gを使用して培養）、E1AB1-X（G）、E1AB1-A3（G）、およびE1AB1-XA3(G)株。 タンパク質濃度は96時間の値から決定されました。 （d）同じタンパク質用量（2.0 mgタンパク質/gセルロース）を使用した微結晶セルロースの糖化。 （ e ）同量の培養上清（0.87 mL培養上清/gセルロース）を使用した微結晶セルロースの糖化。 エラーバーは標準偏差を示します。 統計的有意性は、対応のない両側スチューデント t 検定によって決定されました。 **p < 0.01、*p < 0.05。

微結晶セルロースの糖化は、セルロースを使用する誘導条件下またはグルコースを使用する非誘導条件下で生成される酵素を使用して評価されました。 セルロース1gあたり2.0 mgの酵素を使用した評価では、セルロースで誘導された親株E1AB1によって産生された酵素が、26.8 g-グルコース/Lで最高量のグルコースを放出した。 対照的に、E1AB1-XA3株によって産生される酵素は、非誘導条件で22.5 g-グルコース/Lで最高でした（図4d）。 E1AB1-A3 株の酵素は 17.8 g-グルコース/L を放出しました。 この結果は、E1AB1-X株由来の酵素の結果よりも2.3倍高かった(図4d)。 おそらくタンパク質中のセルラーゼ成分の構成比が高いためではないかと推測しました。 しかしながら、上述したように、E1AB1-A3株が産生する分泌酵素の総量は0.57g/L（図4c）、セルラーゼの絶対量は0.34g/Lであった。 対照的に、E1AB1-X 株由来の酵素カクテルには 2.09 g/L のタンパク質濃度が含まれており、E1AB1-A3 よりも生産性が高かったが、主にキシラナーゼで構成されていました。 その結果、セルラーゼの絶対量は０．２４ｇ／Ｌであった。 したがって、E1AB1-A3株およびE1AB1-X株が生産するセルラーゼ成分は、E1AB1-XA3株のセルラーゼ成分1.25g/Lよりも低かった。 そこで、同量の培養上清0.87mLを用いて糖化を行った。 結果は、E1AB1-A3 株の酵素が 6.5 g-グルコース/L を放出し、E1AB1-X 株の酵素が 7.5 g-グルコース/L を放出し、2 つの酵素が同等の性能を有することを示しました。 対照的に、E1AB1-XA3株からの酵素は、19.9 g-グルコース/Lというかなり多量のグルコースを放出しました（図4e）。 これは、E1AB1-XA3株が、誘導物質を含まない条件下で既存のXYR1V821F過剰発現株よりも優れた酵素を生産できることを示唆しています。

E1AB1-XA3株は、ACE3の構成的発現によるセルラーゼ組成比の増加と、変異XYR1V821Fの導入による非誘導条件下での高いタンパク質生産性という2つの重要な表現型を有することが判明した。 このようにして、我々は、セルロース分解酵素の最も重要な特性、すなわち非誘導生産系におけるセルラーゼ生産の増加を達成することができた。

以前に報告された、突然変異 XYR1V821F または XYR1A824V を使用した T. reesei によるインデューサーフリー酵素生産システムは、主にキシラナーゼを生産し、セルラーゼ発現の弱い活性化を行いました 32,33。 したがって、我々はセルラーゼとキシラナーゼの両方を誘導条件と同じレベルで生産する遺伝子改変戦略を開発しました。 その結果、誘導剤を使用せずにセルラーゼとキシラナーゼを大量に生成することに成功しました。 唯一の炭素源としてグルコースを使用するセルラーゼ生産性の向上は、変異した XYR1V821F または XYR1A824V と、部分的に切断された DNA 結合ドメインを有する ACE3、特に ACE3 の構成的発現によって達成されました。

この報告では、XYR1V821F とセルラーゼ制御関連因子、CRT1、BGLR、VIB1、または ACE2 の共発現はセルラーゼ発現を増加させませんでした (図 2)。 以前、これらの因子の欠失はセルラーゼ発現の損失または低下を引き起こすことが報告されていました 38,39,40,45。 これらの因子は、XYR1 および ACE3 の発現亢進によっても影響を受けました (たとえば、crt1 は ACE338,47 によって制御されます)。 これは、十分な量のこれらの因子が、変異型XYR1V821Fの構成的発現とその後のACE3の上方制御によってすでに上方制御されているため、XYR1V821Fとこれらの因子の共発現の効果は起こらなかった可能性があることを示唆しました（図3e、レーン番号3）。 対照的に、ACE3 共発現の効果はセルラーゼ産生の向上に寄与することが観察され (図 2)、変異 XYR1V821F による上方制御を超えて ACE3 の発現を増強する必要があることが示唆されました。 ACE4 が ace3 プロモーターに直接結合し、ACE3 の発現を調節してセルラーゼ産生を促進することが以前に報告されました 56。 おそらく、ACE3はXYR1だけでなく、ACE4などの他の因子によっても調節されており、XYR1以外の因子によるACE3の発現増強がセルラーゼ発現の鍵である可能性があることが示唆されている。 主要なセルラーゼ/ヘミセルラーゼ発現の制御に加えて、マイナー酵素（XYR1およびACE3の制御下にない）が発現されなかった可能性もあり、さまざまな制御因子およびグリコシドヒドロラーゼファミリーのさらに包括的な発現プロファイル分析には将来の介入が必要です。

XYR1 はセルラーゼおよびキシラナーゼ生成の重要な調節因子の 1 つとして研究されていますが、その詳細な調節機構は依然として不明です。 我々の研究では、野生型XYR1とPT-ACE3（E1AB1-XwtAnhr株）を共発現させても、構成的に発現しているPT-ACE3（E1AB1-A3株）と比較してセルラーゼ生産性の増加は見られませんでした（図3）。 さらに、Rut-C30由来の工業用株では、天然のxyr1プロモーターをホスホグリセリン酸キナーゼ、ヒストン3、塩基性ロイシンジッパー転写因子由来のプロモーターなどの構成的プロモーターで置き換えても、セルラーゼ誘導物質の非存在下ではセルラーゼ生産は増加しなかった。遺伝子12． 対照的に、T. reesei QM9414株において銅抑制性プロモーターPtcu1を使用した野生型XYR1の過剰発現は、グルコース富化培養物において高いセルラーゼ生産をもたらした57。 この研究では、act1 プロモーターが構成的に発現するプロモーターとして選択されましたが、野生型 xyr1 の発現レベルを高めるには不十分である可能性があり、野生型 XYR1 の過剰発現によってセルラーゼが誘導される可能性があります。 対照的に、同じact1プロモーターを使用した変異xyr1V821Fの発現は、非誘導条件下で顕著なキシラナーゼ産生をもたらしました（図1）。 また、セルラーゼおよびヘミセルラーゼ遺伝子の転写を完全に活性化するには、XYR1 の翻訳後修飾が必要である可能性があることも示唆されています 12。 A824V や V821F などの XYR1 の酸性活性化ドメインの変異は、翻訳後修飾を模倣し、少なくとも野生型 XYR1 よりも低いレベルでキシラナーゼ発現を活性化する可能性があります。 したがって、野生型と変異型 XYR1 では同じプロモーター強度を使用してもセルラーゼ/ヘミセルラーゼの発現プロファイルが異なることが示唆され、変異型 XYR1V821F の発現レベルがこの研究で最適であるかどうかを判断するにはさらなる調査が必要です。野生型/変異型 XYR1 の駆動に対するプロモーター強度の影響。

別の修飾因子であるACE3は、セルラーゼ制御において重要な役割を果たすことが示されているが、その機能解析は依然として不明である。 T. リーゼイ NG14 株および派生した RUT-C30 株および RL-P37 株の ACE3 は、C 末端で 11 アミノ酸が切断されており、その結果セルラーゼ生産性が高くなります 42。 さらに、Luo ら。 らは、RL-P37 株を親株として使用し、C 末端の 7 ～ 17 アミノ酸が切断された ACE3 を過剰発現させることにより、インデューサーを含まない条件下でも高いセルラーゼ生産を報告しました 43。 この報告された系では、どの ace3 も完全な野生型 C 末端を持っていません 43。 これに対し、今回のPC-3-7株由来のE1AB1株では、ゲノム中のace3は完全なC末端を有しており、さらに発現が増強されたace3にはC末端変異が存在しなかった。 しかし、変異したXYR1V821Fとの共発現により、非誘導条件下で高いセルラーゼ生産が達成されました（図3a）。 ルオら。 は、ACE3 の C 末端 17 アミノ酸がリプレッサー ドメイン自体であるか、リプレッサーと相互作用するドメインの一部である可能性があることを示唆しました 43。 我々の結果は、ACE3のC末端変異はインデューサーフリーのセルラーゼ生産には必須ではなく、変異したXYR1V821Fとの相互作用が直接的または間接的にACE3のC末端での阻害機能を解除する可能性があることを示した。

さらに、Luo ら。 は、インデューサーフリーのセルラーゼ生産には、N 末端に 6 つすべてのシステインと C 末端に特定の変異を持つ Zn(II)2Cys6 型 DNA 結合ドメインが必要であると報告しました 43。 対照的に、本研究では、完全な N 末端 DNA 結合ドメインを備えた FL-ACE3 の発現により、セルラーゼの生産性が向上しました。 しかし、驚くべきことに、不完全な DNA 結合ドメインを持つ PT-ACE3 の方が生産性が高かった (図 3)。 ACE3 は、ACE3 とホモ二量体、XYR141 とヘテロ二量体を形成し、ネイティブ ACE3 (完全な DNA 結合ドメインを有する)、PT-ACE3、ネイティブ XYR1、または変異型 XYR1V821F と相互作用する可能性がある PT-ACE3 を構成的に発現すると提案されています。 さらに、FL-ace3 の転写レベルは、セルロースを使用した誘導条件下では有意に増加せず、主に PT-ace3 に対応する転写物が増加しました（図 3e、レーン 1）。これは、以前の報告を裏付けています 43。 したがって、セルラーゼの発現には DNA 結合能を持つ ACE3 が必要ですが、必ずしも発現量を増加させる必要はありません。 PT-ACE3 に対応する ACE3 は、誘導物質によるセルラーゼ生産中にも二量体形成および他の因子との相互作用を通じてセルラーゼ発現を調節すると考えられました。 ACE3 の DNA 結合ドメインは、Gal4 様 Zn(II)2Cys6 二核クラスターとして分類されます。 Gal4 はホモ二量体として DNA に結合することが知られています 58。 したがって、DNA結合ドメインの一部が切断されたPT-ACE3とのホモ二量体(PT-ACE3またはネイティブFL-ACE3とのホモ二量体)はDNA結合能を失うと推測された。 しかし、図3eの誘導生産中の共発現および転写増加領域の結果は、PT-ACE3の存在がセルラーゼ生産を正に制御することを示唆しました。 したがって、状態によっては、ACE3 の DNA 結合も阻害に関与している可能性があります。 また、DNAに結合できるXYR1とのヘテロマー化によりセルラーゼ生成が活性化される可能性があるとも考えられていたが、DNA結合ドメインの部分的切断によるACE3の機能についてはさらなる研究が必要である。

xyr1V821F および他のセルラーゼ調節関連因子の挿入に使用される ace125 および rce126 遺伝子座は、既知のリプレッサーでした。 この研究では、総分泌タンパク質濃度は増加しましたが、それらの破壊は必須ではなく、セルラーゼ組成の改善には寄与しませんでした（図3b、c）。 グルコースを使用したE1AB1-XA3株の酵素生産性は、E1AB1-X株およびE1AB1-A3株と比較して向上しましたが、セルロースを使用した親E1AB1株よりわずかに劣りました（図1a、3c、4c）。 これは炭素源としてのセルロースの性質とその誘導性に大きく依存していると思われる。 グルコースは非常に容易に吸収され、急速に消費されます。 したがって、この研究では48時間後に枯渇しました（追加ファイル図S3）。 これに対し、セルロースは吸収されにくく分解が遅く、長期間にわたってセロビオースやグルコースを放出するため、CCRを引き起こしにくいと考えられています。 本研究で用いた E1AB1 株は、変異育種を繰り返した工業用株であり、cre1 変異 50 やα-チューブリン（tubB）破壊 54 により、CCR を含む各種抑制規制が解除されている。 しかし、この株でも酵素の産生はわずかであり、グルコース濃度は高かった（追加ファイル図S3）。 Luo et al.43 はまた、(ヘミ) セルラーゼの生成は、グルコースが特定の閾値以下に枯渇し、CCR が完全には克服されなかった後にのみ発生すると述べています。 現状では、セルロースを用いた培養と同等の高いセルラーゼ生産性を実現するには、CCR を回避するための実践（例えば、流加培養 59,60）が必要であり、XYR1 や ACE3 などの活性化因子の構成的発現だけでは CCR を克服することはできません。 。 したがって、これらの活性化因子の改変に加えて、抑制機構のさらなる研究が必要である。

T. reesei はその高い生産能力により、異種タンパク質生産の有望な宿主です。 しかし、従来のセルロースベースの酵素生産システムを使用して異種タンパク質を生産することは困難です61,62。 セルラーゼの遺伝子を目的のタンパク質の遺伝子に置き換えると、セルロースが分解できず、誘導物質が放出されず、タンパク質の生産能力が低下します。 逆に、セルラーゼが破壊されない場合、大量の天然セルラーゼが汚染されることになります62。 以前の報告では、xyr1A824V63 を備えた xyn1 および xyn2 プロモーターを使用した異種タンパク質の生産が示されています。 しかし、この研究の結果は、cbh1 や cbh2 などの非常に強力なセルラーゼ プロモーターを、セルラーゼを共生産することなく異種タンパク質の生産に使用することが可能になったことを示しています。 このような強力なセルラーゼプロモーターは、バイオエタノール生産のための糖化酵素やさまざまな貴重なタンパク質の発現に使用できる優れた生産性ツールとして期待されています。

この研究で使用した T. リーゼイ株を表 1 に示します。T. リーゼイ株 E1AB153 および E1AB1Δpyr4 (ウラシル栄養要求性) は、W. 小笠原教授 (長岡技術科学大学) のご厚意により提供されました。 株をポテトデキストロース寒天培地（ＰＤＡ；Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ミシガン州デトロイト）プレート上で維持した。

前培養酵素の生産のために、各菌株の 4 × 105 個の胞子を、10 mL 培養チューブ内の 1% (w/v) グルコースを含む 2 mL の基礎培地 48 に接種しました。 胞子は、Thoma血球計（Sunlead Glass Corp.）を使用して計数された。 基本培地は、0.14% (w/v) (NH4)2SO4、0.2% (w/v) KH2PO4、0.03% (w/v) CaCl2・2H2O、0.03% (w/v) MgSO4 7H2O、0.1% (w/v) を含みました。 /v) ポリペプトン、0.05% (w/v) 酵母抽出物、0.1% (w/v) Tween 80、および 50 mM 酒石酸 Na 緩衝液 (pH 4.0) 中の 0.1% (w/v) 微量元素溶液。 微量元素溶液は、100 mL の蒸留水中に 6 mg の H3BO3、26 mg (NH4)6Mo7O24 ・ 4H2O、100 mg の FeCl3 ・ 6H2O、40 mg の CuSO4 ・ 5H2O、8 mg の MnCl2 ・ 4H2O、および 200 mg の ZnCl2 を含みました。 前培養は、220 rpm、28 °C で 2 日間振盪することによって実行されました。 本培養のそれぞれについて、前培養物 500 μL を、3% (w/v) 粉末セルロース (KC FLOCK W-400G、日本製紙) またはグルコースおよび 1.28% (w/v) を含む 50 mL の基礎培地に接種しました。 ) クエン酸水素二アンモニウムを 500 mL 三角フラスコに入れた。 主培養物を 220 rpm、28 °C で 3 ～ 5 日間振盪しました。 サンプリングのために、培養液から16,000gで5分間遠心分離して細胞を除去し、上清を0.20μm酢酸セルロースメンブレンフィルター（13CP020AN；アドバンテック、東洋濾紙）で濾過した。 すべての実験は 3 回繰り返して実行されました。

T. reesei 株 PC-3-7 のゲノム DNA から目的の遺伝子を増幅し、pUC118 (タカラバイオ) を鋳型として逆ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) によりベクター断片を増幅しました。 SwaI切断部位を追加するプライマーを使用して設計された増幅断片を、In-Fusion HDクローニングキット(Clontech)を使用して製造業者のプロトコールに従ってライゲーションした。 クローニング宿主として大腸菌DH5aを用い、プラスミドDNAの精製にはNucleoSpin® Plasmid miniprep kit（タカラバイオ）を使用した。 クローン化された遺伝子とプライマーの詳細は、追加ファイルの表 S5 に記載されています。 ベクターフラグメント pUC-K017 はインバース PCR によって生成されました。 それは、連結されたace1挿入プラスミド(pUC-K003)およびpyr4マーカーカセット(pUC-K016)に由来する。 ace1破壊構築物の逆PCRフラグメント(pUC-K017)とact1プロモーター、xyr1、およびcbh1ターミネーターのフラグメントを連結して、プラスミドΔAce1-Pact1-xyr1-pyr4(pUC-K019)を生成した。 このプラスミドを鋳型としてインバースPCRを行い、821位のバリンをフェニルアラニンに変異させてΔAce1-Pact1-xyr1V821F-pyr4（pUC-K020）を得、824位のアラニンをバリンに変異させてΔAce1-Pact1-xyr1A824V-を得た。 pyr4 (pUC-K021)。 同様に、rce1 破壊コンストラクトのインバース PCR フラグメント (pUC-K018)、act1 プロモーター、ORF (crt1、bglr、vib1、ace2、PT-ace3、FL-ace3)、および cbh1 ターミネーターのフラグメントを分析しました。ライゲーションして、それぞれプラスミドｐＵＣ－Ｋ０２２、ｐＵＣ－Ｋ０２３、ｐＵＣ－Ｋ０２４、ｐＵＣ－Ｋ０２５、ｐＵＣ－Ｋ０２６、およびｐＵＣ－Ｋ０２７を生成した。 PT-ace3 および FL-ace3 については、pUC-K010 をテンプレートとして使用し、2 種類の推定開始コドンに基づいてフォワード プライマーを設計しました。 ベクター構築および使用されるプライマーの詳細については、追加ファイルの表 S6 に記載されています。

T. reesei の形質転換前にプラスミドを SwaI で線形化するか、改変プロトプラスト PEG 法 64 を使用して PCR 産物を形質転換します。この方法では、Novozyme 234 の代わりに 20 mg/mL の Yatalase (Takara Bio) をプロトプラスト酵素として使用します。 (Novozymes Bagsværd、デンマーク)。 形質転換されたプロトプラストを最小形質転換培地[2.0% (w/v) グルコース、18.27% (w/v) ソルビトール、0.5% (w/v) (NH4)2SO4、0.2% (w/v) CaCl2、0.06 pyr4 マーカーの場合は、100 mM KH2PO4 緩衝液 (pH 5.5) 中の % (w/v) MgSO4、0.21% (w/v) CsCl、および 0.1% (w/v) 微量元素溶液]。 微量元素溶液は、100 mL の蒸留水中に 500 mg の FeSO4 ・ 7H2O、200 mg の CoCl2、160 mg の MnSO4 ・ H2O、および 140 mg の ZnSO4 ・ 7H2O を含みました。 30℃で2週間インキュベートした後、単一コロニーを単離するために、候補形質転換体を選択プレート（それぞれソルビトールを含まない最小形質転換培地）上で30℃で数日間２回画線培養した。 次に、単一コロニーを PDA プレートに移し、30 °C で 1 週間放置して分生子を形成させました。 メーカーのプロトコールに従い、KOD One (東洋紡社)を用いたコロニーPCRにより形質転換体を1つ確認した。 得られた形質転換体を0.2%(w/v)の5-フルオロオロチン酸(5-FOA)一水和物を含むPDA培地を用いて再度形質転換するため、再度5-FOA耐性を獲得した株(相同組換えによるpyr4ポップアウト)を選抜した。

製造業者のプロトコールに従って、タンパク質濃度は、ウシガンマグロブリンを標準としてブラッドフォードタンパク質アッセイ(Bio-Rad)を使用して測定した。 上清中のグルコース濃度は、グルコースCIIテストワコーキット（和光ケミカルズ）を用いて定量した。 具体的には、96ウェルプレート中の希釈上清1μLに反応液150μLを加えてよく混合し、室温で15分間インキュベートした。 すべてのサンプルおよび標準の吸光度は、マイクロプレートリーダー (Molecular Devices) を使用して 505 nm で測定されました。

遠心分離により集めた48時間後の細胞ペレットを軽く脱水し、液体窒素中で凍結させた。 製造業者の説明に従って、マルチビーズショッカー (安井機械株式会社) を使用して 1700 rpm で 10 秒間粉砕する前に、金属コーンを凍結サンプルに置き、その後 RNeasy Mini Kit (Qiagen) を使用して RNA 抽出を実行しました。プロトコル。 gDNA 消化と cDNA 合成は、それぞれ ezDNase™ Enzyme (Invitrogen) と SuperScript™ IV VILO™ Master Mix (Invitrogen) を使用して実行されました。 RT-qPCR実験は、Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mixes（Agilent）を使用して実行され、転写レベルは、ノーマライザーとしてpgk1遺伝子とE1AB1（図3d、e）またはE1AB1-Xを使用するΔΔCt法を使用して評価されました。 (図 4a) キャリブレーターとしてのひずみ。 すべてのサンプルは少なくとも 3 つの独立した生物学的実験で分析されました。 リアルタイム PCR に使用されるプライマーは、Primer3 (https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/) を使用して設計されており、追加ファイルの表 S4 にリストされています。

SDS-PAGE は、Any kD Mini-PROTEAN TGX プレキャスト プロテイン ゲル (Bio-Rad) を使用して 200 V で 35 分間実行されました。ゲルを 5 分間活性化し、ChemiDoc MP イメージング システム (Bio-Rad) を使用してイメージングしました。 分子量マーカーとして、Precision Plus Protein Unstained Standard (5 μL; Bio-Rad) を使用しました。 特に明記しない限り、2.5μgのタンパク質を各ウェルにロードした。 15 kDa未満では明確なバンドが検出されなかったため、ゲルは15〜250 kDaの範囲で切り取られました（図1b、2b、および3bの元のゲルは図S4、S5、およびS6に示されています。追加のファイルを参照）。 タンパク質バンドの分子量は、Image Lab ソフトウェア (BiFio-Rad) を使用して推定され、タンパク質バンドには、以前に報告されたセルラーゼおよびキシラナーゼに対応する位置を使用して注釈が付けられました 53。 ナノ LC-MS/MS システムを使用したタンパク質の同定は、ジャパン プロテオミクス株式会社で実施されました。

セロビオヒドロラーゼ、β-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、β-キシロシダーゼの酵素活性は、基質 p-ニトロフェニル-β-d-ラクトシド (pNPL)、p-ニトロフェニル-β-d-グルコピラノシド (pNPG)、p-ニトロフェニルを使用して測定しました。それぞれ -β-キシロビオシド (pNPX2)、および p-ニトロフェニル-β-d-キシロピラノシド (pNPX)。 反応は、50 mM 酢酸ナトリウム中、pH 5.0、50 °C で 10 分間行い、1 倍量の 1 M Na2CO3 を加えて停止させました。 放出されたp-ニトロフェノールは、420 ​​nmでの吸光度を測定することによって定量されました。 活性の 1 単位は、50 °C で 1 分間に 1 μmol の p-ニトロフェノールを生成する酵素の量として定義されます。 セルロースの糖化は、100 mM 酢酸ナトリウム緩衝液 (pH) 中で 5% (w/v) の微結晶セルロース (Avicel® PH-101、Sigma-Aldrich) を添加し、9 mL ガラスねじ口ボトル内で 1 mL スケールで実行されました。 5.0、2.0 mg タンパク質/g セルロースの酵素負荷を使用。 タンパク質濃度は上記のように決定した。 反応は、150 rpmで振盪しながら50℃で72時間実施した。 糖化後に得られたサンプルをろ過（0.2μm）し、酵素アッセイおよび多機能バイオセンサーBF-7（王子計測機器）を用いてメーカーのプロトコールに従ってグルコース濃度を測定した。

すべての実験は少なくとも 3 つの独立したサンプルを使用して実行されました。 エラーバーは、三重測定の平均の標準偏差 (SD) を示します。 統計的有意性は、対応のない両側スチューデント t 検定によって決定されました。 各実験セット内で、p < 0.05 が有意であるとみなされました。

この研究で使用したタンパク質およびヌクレオチド配列は、以下のアクセッション ID で Uniprot から参照できます: ACE1_G0RCC6、RCE1_G0RBV8、XYR1_G0RLE8、CRT1_G0RGH7、BGLR_G0RVU2、VIB1_G0R8Z5、ACE2_G0RKV9、ACE3 (部分的に短縮)_G0RIA0、ACE 3 (全長)_A0A5C1J077。

β-グルコシダーゼ

β-キシロシダーゼ

セロビオヒドロラーゼ

炭素異化産物の抑制

エンドグルカナーゼ

ポリメラーゼ連鎖反応

p-ニトロフェニル-β-d-グルコピラノシド

p-ニトロフェニル-β-d-ラクトシド

p-ニトロフェニル-β-d-キシロピラノシド

p-ニトロフェニル-β-キシロビオシド

キシラナーゼ

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T. reesei E1AB1 株を提供していただいた長岡技術科学大学の小笠原渉教授と、本研究について議論することで考察を深めていただいた神戸大学の石井教授に感謝いたします。 英語の編集については Editage (www.editage.com) に感謝します。

花王株式会社生物科学研究所、〒640-8580 和歌山県和歌山市港1334

Toshiharu Arai, Sakurako Ichinose, Nozomu Shibata, Hiroshi Kakeshita, Hiroshi Kodama, Kazuaki Igarashi & Yasushi Takimura

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TA、SI、H.Ka. 研究を設計した。 TA は結果を分析し、原稿を作成しました。 SI は株の構築と遺伝子解析に参加しました。 H.Ka. 原稿を修正した。 NS、H.Ka.、H.Ko.、KI、YT が原稿をレビューし、コメントしました。 著者全員が最終原稿を読んで承認しました。

掛下宏氏への対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

新井 哲也、一ノ瀬 晋、柴田 直也 他工業用真菌トリコデルマ リーゼイにおける変異 XYR1 および ACE3 の構成的発現に基づく、インデューサーフリーのセルラーゼ生産システム。 Sci Rep 12、19445 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-23815-4

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受信日: 2022 年 4 月 23 日

受理日: 2022 年 11 月 7 日

公開日: 2022 年 11 月 14 日

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