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Jun 27, 2023

サリチル酸フェニルエチルエステル (SAPE) の合成と免疫調節および抗がん作用におけるその関与

Rapporti scientifici Volume 12,

Scientific Reports volume 12、記事番号: 8735 (2022) この記事を引用

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メトリクスの詳細

サリチル酸フェニルエチルエステル (SAPE) は、サリチル酸とフェニルエチルアルコールの Zn(OTf)2 触媒による選択的エステル化によって合成され、免疫調節剤および抗がん剤としての役割が研究されました。 毒性が低く、物理的特性、リピンスキー型特性、溶解度特性が良好であることが、ADME-tox 研究によって解明されました。 COX-2 に対する SAPE の分子ドッキングにより、イブプロフェンやインドメタシンと比較して、良好な MolDockscore、リランク スコア、相互作用エネルギー、内部ポーズ エネルギー、および水素結合が明らかになりました。 20 ns MD シミュレーション中に、安定した動的平衡条件を備えたドッキング複合体の平均 RMSD ～ 0.13 nm が記録されました。 酵素の活性部位での強い結合親和性を予測する低いバンドギャップは、DFT 分析によってさらに予測されました。 このエステルは赤血球の溶血率の低下を引き起こし、MTT アッセイによりヒトリンパ球、CaCo-2、および HepG-2 細胞に対して非細胞毒性であることが示されました。 さらに、LPS刺激腸細胞および直接隔離アッセイの両方下でのCOX-2酵素阻害におけるインビトロ有効性は、サリチル酸およびインドメタシンよりも高いことが判明した。 SAPE の抗がん活性は乳がん細胞株 MCF-7 で試験され、細胞生存率の低下という点で潜在的な有効性が示されました。 フローサイトメトリー分析では、G1/G0 期および S 期での細胞周期の停止が示され、その間、ROS 産生の増加によるオートファジー小胞形成の誘導とミトコンドリア膜電位の低下が観察されました。 さらに、これらの段階では、DNA 損傷を伴うアポトーシスの開始も観察されました。 大腸炎を誘発した Wistar ラットを SAPE で前処理すると、疾患活動性指数が低く、腸組織破壊および脂質過酸化の程度が減少したことが示されました。 治療群の腸組織抽出物中の抗酸化酵素、すなわちカタラーゼ、GGT、およびGSTの顕著な増加、および炎症促進性サイトカインIL-6およびTNF-αの減少が認められた。 この研究の結果は、合成エステル (SAPE) が癌の効果的な管理のための治療可能性を備えた抗酸化および抗炎症化合物であると考えられることを裏付ける十分な信憑性を持っています。

フェノールエステルは部分的に水に溶け、抗酸化特性を示し、天然物に豊富に含まれています1。 これらは、ミツバチプロポリスのフェノール活性成分であるカフェ酸フェネチルエステル（CAPE）など、抗炎症作用、抗酸化作用、免疫調節作用、抗がん作用などのさまざまな薬理学的活性を持っています2。 これらの化合物は構造的に単純ではありません。 しかし、それらの合成は、化学選択性を向上させるための保護基の負荷、または過酷な条件の使用または反応物質の 1 つの過剰な使用により、通常は複雑になります 3、4。 エステル化の収率は、カルボキシル基の反応性とアルコールの炭素鎖長に影響を与えるフェノール酸の電子分布に関連しています1。 カルボン酸官能基のエステル化は、標準化合物と比較した場合、潰瘍形成効果が減少しながらも、より高い抗炎症活性を明らかにしました5。 さらに、アセチルサリチル酸、サリチル酸、フルフェナム酸、トルメチン、およびその他のさまざまな非ステロイド系抗炎症酸のエステル化により、胃潰瘍形成活性が低下するメチルエステルが生成されます6。

サリチル酸は薬理学的に活性なフェノール化合物であり、さまざまな植物に含まれています。 その作用機序には、プロスタグランジン合成阻害およびシクロオキシゲナーゼ遺伝子の転写抑制が含まれます7。 サリチル酸の抗心臓脳血管疾患および抗癌作用が報告されています8。 サリチル酸の誘導体であるアセチルサリチル酸は、世界で最も広く使用されている抗炎症薬の 1 つであり、抗がん作用を誘導します 57。 Rigas と Kozoni10 は、アスピリンの新しいフェニルエステル誘導体を合成し、この化合物は抗増殖効果とアポトーシス促進効果の組み合わせによってヒト結腸腺癌細胞 (HT-29) の増殖を阻害しました。 Çalışkan ら 11 はまた、一連の新規な 1-ベンジル-5(3)-p-トリル-1H-ピラゾール-3(5)-カルボン酸誘導体を合成し、これらの化合物の一部が鎮痛および抗炎症活性を示すことを発見した。 。 最近、Liu ら 12 はサリチル酸とα-アミノホスホネートの反応により新しい誘導体を合成し、合成されたサリチル酸誘導体が肝臓癌および子宮頸癌細胞株に対して阻害活性を有することを実証した。

サリチル酸は肝臓ミクロソームヒドロキシラーゼによるヒドロキシル化によりゲンチシン酸を形成するため、酸化に非常に敏感であり、ゲンチシン酸はさらに反応してH2O攻撃により他のヒドロキシル化誘導体を生成する可能性があります。 しかし、酸化サリチル酸誘導体は、単一の電子または水素原子供与体として機能する能力の一部により、抗酸化活性が増加しています13。 これらのフェノール誘導体は急性毒性が低く、オルトまたはパラ位にある 2 番目の OH 基が抗酸化活性を高めます。 さらに、モノフェノールの活性は、メトキシル置換基が 1 つまたは 2 つあると大幅に増加します 14。 サリチル酸エステルは幅広い生物学的活性を有しており、メタノールによるサリチル酸のエステル化は、Ce4+ 修飾カチオン交換樹脂 15 や、ジルコニア、アルミナ、シリカなどのアニオン修飾金属酸化物 16 などのさまざまな触媒を使用して行われています。

ライスビール（インド、アッサム州の伝統的な発酵製品）を用いた以前の研究では、スタータープラントにかなりの量のサリチル酸が存在し17、最終製品には2-フェニルエタノール（PEA）が存在することが明らかになりました18。 PEA は発酵食品に含まれる芳香族アルコールであり、さまざまな酵母菌株が 3 つの酵素が関与するエールリッヒ経路を介して L-フェニルアラニンから PEA を生成します19。 トリフルオロメタンスルホン酸亜鉛 [Zn(OTf)2] を触媒として使用したサリチル酸のフェニルエチルアルコールによるエステル化については報告がなかったため、初めて Zn(OTf)2 触媒によりサリチル酸フェニルエチルエステル (SAPE) が合成されました。選択的エステル化。 合成されたエステルは、インシリコ、インビトロ、およびインビボのアプローチにより、抗酸化剤、抗炎症剤および抗がん剤としての免疫調節の役割についてさらにテストされました。

SAPE の生成反応を図 SF1 に示します。 化合物濃度の点では、40:60 の酢酸エチル:ヘキサン混合物が最良の結果をもたらしました。 合成されたSAPE分子の 13 C NMRおよび 1 H NMRプロットを図1および2に示します。 それぞれSF2とSF3。 合成されたSAPE分子のFTIRプロットを図SF4に示します。 得られたデータは次のとおりです: 13C (ppm): 3409、65.8、112.1、118.1、119.2、126.12、129.0、130.1、131.1、135.2、138.1、161.8、170.1。 FTIR (cm−1): 501、672、750、1070、1110、1220、1292、1480、1683、3150。 1H (ppm): 3.1 (t,2H)、4.52 (t,2H)、6.7 ～ 6.98 ( m、2H)、7.1 ～ 7.48 (m、5H)、7.7 ～ 7.8 (m、2H)、10.7 (s、1H)。

ADME の毒性特性は、薬物の生物学的効果と生物体内での運命に直接関係しており、コンピュータでの手法により、薬物設計の初期段階でこれらの特性を予測できます 20。 ACD/Labs I-Lab 2.0によって予測されたSAPE分子の溶解度、分布容積、吸収、血液脳関門輸送、バイオアベイラビリティ、健康への影響およびLD50値を表ST1に示します。 溶解度 (LogSw) は - 4.03、吸収 (LogP) は 4.15、血液脳関門輸送 (LogP) は 4.15、分布容積は 0.44 L/kg であることが判明しました。 最大受動吸収は細胞経由経路から 100% でしたが、ヒト空腸の透過性は 7.51 × 10−4 cms−1 でした。 化合物が %F (経口) > 30% のバイオアベイラビリティを持つ確率は 0.811、%F (経口) > 70% のバイオアベイラビリティを持つ確率は 0.358 でしたが、血液に対する影響の確率は 0.39 でした。 心血管系 0.5; 胃腸系は0.6、腎臓は0.26、肝臓は0.14、肺は0.19でした。 ラットの LD50 値は、570 mg/kg (腹腔内投与) および 2500 mg/kg (経口投与) であることが判明しました。 SAPE の CNS 活性も図 SF5 に示されています。 ＳＡＰＥの予測される物理化学的特性、すなわちモル屈折率、モル体積、パラコール、屈折率、表面張力、密度および分極率、ならびにＳＡＰＥの質量分析関連特性を表ＳＴ４に示す。 さらに、リピンスキー型の特性も推定され、良好であることがわかりました (表 ST2)。

最初に、COX-2 上の潜在的なリガンド結合部位 (活性部位) の予測では、キャビティ容積が 56.32 Å3、キャビティ表面が 175.36 Å2、X: 13.44 に位置することが示されました。 Y: 24.14; Z: 24.58、結合部位半径 15 Å (図 SF6)、SAPE、イブプロフェン、インドメタシンに対して分子ドッキング シミュレーションを実行しました。 グリッドベースのスコアリング関数である MolDock スコア [GRID] を使用して、ドッキング ソリューションを評価しました。 研究対象の化合物はいくつかの内部自由度を持っていたため、MolDock SE が代替検索アルゴリズムとして使用されました 21。 COX-2の活性部位にドッキングした上位のポーズを図1[i]A、B、C、D、E、Fに示し、その値をRerankスコアに基づいてランク付けしました（表1）。

[i] (A) SAPE と COX-2 酵素の活性部位残基との間のタンパク質-リガンド相互作用 (B) COX-2 酵素の活性部位残基における SAPE の結合様式 (C) イブプロフェンと活性部位との間のタンパク質-リガンド相互作用COX-2 酵素の残基 (D) COX-2 酵素の活性部位残基におけるイブプロフェンの結合様式 (E) インドメタシンと COX-2 酵素の活性部位残基との間のタンパク質-リガンド相互作用 (F) COX-2 酵素の活性部位残基におけるインドメタシンの結合様式COX-2酵素の活性部位残基。 [ii] SAPE-COX-2 がイブプロフェンおよびインドメタシン複合体よりも安定であることを示すドッキングタンパク質リガンド複合体の RMSD プロットを示す MD シミュレーション。 [iii] (a) DFT/B3LYP/6-31G 理論レベルで計算された SAPE の HOMO (E = -6.29 eV) を示す分子軌道。 (b) DFT/B3LYP/6-31G 理論レベルで計算された SAPE の LUMO (E = -1.09 eV) を示す分子軌道。

分子ドッキング スコア (表 1) から、SAPE が良好なドッキング スコアで COX-2 タンパク質の活性部位にドッキングできることが明らかになりました。 これは、この酵素が通常、イブプロフェンやインドメタシンと比較して SAPE に有利であることを示しています。 分子ドッキング エンジンでは、MolDock スコア、Rerank スコア、および相互作用エネルギーに基づいて、SAPE、イブプロフェン、インドメタシンがドッキング ヒットのトップ 5 としてランク付けされました。 本研究で使用される MolDock スコアは、もともと Gehlhaar らによって提案され 22、後に Yang らによって拡張された PLP スコアリング関数から導出されています 23。 ドッキングスコアリング関数 Escore は、EScore = Einter + Eintra として定義されます。ここで、Einter はリガンドとタンパク質の相互作用エネルギー、Eintra はリガンドの内部エネルギーです。 一方、リランク スコアは、リガンドとタンパク質間の E-inter (立体、ファン デル ワールス、水素結合、静電) と E-intra (ねじれ、sp2-sp2、水素結合、ファン デル ワールス、静電気) の線形結合です。静電）、事前定義された係数によって重み付けされたリガンドの。

分子相互作用を調べるために、MVD Ligand Energy Inspector を使用して、ドッキング ヒット SAPE、イブプロフェン、およびインドメタシンのリガンド - タンパク質相互作用分析を評価しました。表 2 に、ドッキング ヒットの分子相互作用の詳細を示します。 残基相互作用とそれらの相互作用距離を含むリガンドとタンパク質の相互作用が決定され、それにより、SAPE は Leu353(O) および Tyr356(OH) と分子相互作用を示し (図 1A および B)、イブプロフェンは Arg121(NH2) および Tyr356(OH) と分子相互作用を示しました。 (図1CおよびD)一方、Arg514(NH)およびHis90(NE)を有するインドメタシン(図1EおよびF)。 ドッキングヒットのエネルギーマップと静電相互作用を図1と図2に示します。 SF7A および B、SF8A および B、および図 SF9A および B。 有利な立体相互作用 (緑色)、有利な水素受容体 (青緑色)、有利な水素供与体 (黄色) および静電相互作用に寄与する酵素のエネルギー マップ。ドッキングされた化合物も好ましい分子相互作用をサポートします。

MD シミュレーションは、ドッキング ヒット (SAPE-COX-2、イブプロフェン-COX-2、およびインドメタシン-COX-2 ドッキング複合体) についてのみ実行されました。 タンパク質リガンドドッキング複合体のRMSDデータをプロットし、図1[ii]に示しました。 タンパク質-リガンド結合複合体の構造変化と動的環境で発生するタンパク質を理解するための20 ns MDシミュレーションのRMSDバックボーンが計算されました。 RMSD プロットは、COX-2 タンパク質とタンパク質-リガンド結合複合体の変動を明確に説明しています。 SAPE-COX-2 ドッキング複合体の平均 RMSD は約 0.13 nm を示しました。 一方、タンパク質は約 0.23 nm の平均 RMSD 偏差を示し、タンパク質-リガンド複合体のより安定した動的平衡状態を明らかにしました。 これにより、20 ns のシミュレーション実行中のドッキング複合体とシミュレートされた複合体の構造安定性が確認されます。

SAPE の HOMO エネルギーと LUMO エネルギーをそれぞれ図 1[iii] A と B に示します。 これらのエネルギーは、ドッキング ポーズのバンド ギャップ エネルギーを理解するのに役立ちます。 バンドエネルギーギャップが低いことは反応性が高いことを示しており、したがって化合物はタンパク質の活性部位に結合するのに十分強いと考えられます。 バンド ギャップ エネルギー (ΔELUMO-HOMO) は - 5.12 eV で、これはバンド ギャップが低いことを裏付けており、標的酵素の活性部位で確実に強い結合親和性を有することになります。 SAPEの静電ポテンシャルを示す等高線図とSAPEの予測IRスペクトルもDFT / B3LYP / 6-31G理論レベルで計算され、これらはそれぞれ補足図SF10およびSF11に示されています。

溶血率に関する膜安定性アッセイの結果を図 2A に示します。 ネガティブコントロール PBS の場合は 0.0704%、ポジティブコントロール Triton X-100 の場合は 100% であることがわかりました。 一方、SAPE の場合、25 µg/mL では 58.08% であることが判明し、陽性対照とは P ≤ 0.01 で有意な差がありました。 また、50 μg/mL および 100 μg/mL ではそれぞれ 56.28% と 54.88% であり、陽性対照とは有意な差がありました (P ≤ 0.001)。 したがって、200 μg/mL までの SAPE の表面官能化により、赤血球に安定性が与えられ、溶血がかなりの範囲で防止されることが観察されました。 SAPE の濃度が増加するにつれて膜の安定性が増加することも観察されました。 Triton X-100 は通常、細胞を溶解するか、生細胞の膜を透過させるために使用されます。 SAPE の存在下では、Triton X-100 は未使用のサンプルよりも溶血が大幅に少ないことが観察されました。

(A) 赤血球における SAPE の膜安定性アッセイ、および (B)、(C)、(D) (A) PBMC、(B) Caco2、および (C) HepG2 細胞の細胞に対する 48 時間の SAPE の細胞生存率アッセイの結果(25、50、および 100 μg/ml) の用量、またはビヒクル対照として 0.1% DMSO を使用し、MTT ベースの方法で測定しました。 グラフは、3 つの独立したセットの生細胞と死細胞の平均 ± SEM パーセンテージで表示されました。 データは平均±SEMとして表されます。対照と比較して、***P ≤ 0.001、**P ≤ 0.01、および *P ≤ 0.05 で値が有意でした。

PBMC、結腸癌由来のヒト腸細胞株 (CaCo-2)、および肝臓癌細胞株 (HepG-2) に対する SAPE の MTT アッセイの結果をそれぞれ図 2B ～ D に示します。 PBMC の場合、細胞生存率に有意差 (P ≤ 0.05) は観察されませんでしたが、CaCo-2 細胞を用いたアッセイの結果では、SAPE の濃度が増加するにつれて生存細胞の割合が増加することが明らかになりました。 コントロールと比較して、25、50、および 100 μg/mL の SAPE で処理した後の生細胞数に有意な変化はありませんでした。 ただし、200 μg/mL の SAPE では有意差 (P ≤ 0.05) が観察されました。 CaCo-2 細胞は、小腸に見られる刷子縁層を持つ成熟した吸収性腸細胞のいくつかの形態的および機能的特徴を発現するため 24,25 、その結果は SAPE の細胞取り込みの安全性を裏付けるものです。 HepG-2 はほとんどの薬物代謝酵素を発現し 26、HepG-2 を用いたアッセイでは、SAPE 濃度の増加に伴って生細胞の割合が減少したにもかかわらず、生細胞の割合に有意な変化は見られなかった (P ≤ 0.05)。対照と比較した、さまざまな濃度のSAPEで処理した後の生存細胞の数。

COX-2 はシクロオキシゲナーゼの誘導性アイソフォームであり、主に炎症組織で生成され、健康な組織には事実上存在しません。 これは、病的状態下でエンドトキシン、マイトジェン、サイトカインなどの炎症誘発物質によって遊走細胞や他の細胞で誘導されます 27。多くの抗炎症作用、解熱作用、鎮痛作用、および抗血栓作用は、NSAID による COX-2 活性の阻害に起因すると考えられています。 LPS刺激CaCo-2細胞アッセイでは、未処理の刺激細胞を対照として考慮することによってCOX-2産生の阻害率を計算し、結果を図3Aに示します。 フェニルエチルアルコール単独ではCOX-2阻害活性を持たないことが観察された。 このエステルは、研究したすべての濃度 (25、50、および 100 μg/ml) でサリチル酸よりも優れた COX-2 阻害を示しました。 さらに、これらの濃度では、その COX-2 阻害活性はインドメタシンと同等でした。 直接阻害アッセイでも、SAPE の活性がより高いことが観察されました (図 3B)。 100 μg/ml の濃度では、SAPE によって得られた相対阻害率 (79.42%) は、サリチル酸 (68.13%) およびインドメタシン (65.69%) の両方よりも高かった。 さらに、サリチル酸 (58.84 μg/ml) やインドメタシン (12.69 μg/ml) と比較して SAPE の IC50 値 (9.37 μg/ml) が低いことは、in vitro 条件下でのエステルの高用量有効性を明確に示しています。

(A) 炎症を起こした CaCo-2 細胞における COX-2 産生の阻害、および (B) フェニルエチルアルコール (PEA)、サリチル酸 (SA)、サリチル酸フェニルエチルエステル (SAPE) による COX-2 の直接相対阻害）およびインドメタシン（IM）。

結果から、サリチル酸のエステル化によりサリチル酸の抗炎症活性が大幅に増加することが明らかとなり、これらの結果は以前の知見と裏付けられる5、13、14。 COX-2活性を阻害する化合物は、炎症反応の治療と人間の健康維持の両方において重要であるため、この研究結果は膨大である。 これは、COX-2 の異常発現が結腸直腸がんなど多くの種類のがんの病因に広く関与しており、その高レベルががん患者の生存率の低下と関連しているためです28。

MCF-7細胞に対するSAPEの細胞毒性効果を決定するために、MTT法（図4a）およびトリパンブルー色素排除法（図4b）を使用して細胞生存率アッセイを実施しました。 さまざまな用量 (25、50、および 100 μg/mL) の SAPE で処理した細胞を、生細胞数と死細胞数に対する効果について評価し、48 時間の終了時に計算しました。 総細胞数の減少には、重大な細胞死の増加が伴うことが観察されました。 結果は、ヒト PBMC、Caco2、および HepG2 細胞を用いた研究から明らかなように、SAPE が濃度の増加に伴って指数関数的に増加する MCF-7 細胞の生存率を有意に阻害できる一方、同時に正常細胞には顕著な影響を及ぼさないことを明確に示しました。したがって、SAPE の効果は癌細胞に対して選択的であることが示唆されました。

(a) MTT ベースの方法によって測定された、MCF-7 細胞に対する SAPE の細胞生存率アッセイの結果。 （ b ）トリパンブルー排除法を使用した、用量（25、50、および100μg/mL）またはビヒクル対照として0.1％DMSOを使用したMCF-7細胞に対する48時間のSAPEの細胞生存率アッセイ。 グラフは、3 つの独立したセットの生細胞と死細胞の平均 ± SEM パーセンテージで表示されます。 値は、対照と比較して *P ≤ 0.05、**P ≤ 0.01、および ***P ≤ 0.001 で有意でした。

MCF-7 細胞株は、ER 陽性の管腔サブタイプのヒト乳癌です 29。 MCF-7 細胞を SAPE で処理すると、さまざまな細胞周期相の分布が変化する傾向があることがわかりました。 図５Ａから明らかなように、ＳＡＰＥによる処理は、未処理の細胞と比較して、Ｇ０／Ｇ１期およびＳ期の細胞の割合の減少をもたらした。 これは、サブ G1 細胞が実際には DNA 含量の低いアポトーシス細胞であるため、SAPE がアポトーシスの誘導をもたらすことを示しています。 G2/M 期およびアポトーシス期では、SAPE による治療により細胞の割合が大幅に増加することがわかりました。 したがって、SAPE は、MCF-7 細胞において用量依存性の顕著な G2/M 停止を誘導します (P ≤ 0.001)。 ただし、SAPE の用量が 100 μg/mL まで増加すると、G1 期の細胞の割合が大幅に減少したにもかかわらず、より多くの細胞が S 期およびアポトーシス期でも停止することがわかりました (図 5A) の細胞周期。 これらの結果は、細胞増殖の阻害が G1 期に入る細胞数の増加につながり、その後細胞アポトーシスを誘導することを示唆しています。

(A) フローサイトメーターで検出された細胞周期位相分布の 48 時間に対する、25、50、100 μg/mL の用量またはビヒクルコントロールとして 0.1% DMSO を使用した MCF-7 細胞上の SAPE の細胞周期分析。 DNA 含有量のヒストグラム表示。 PI 蛍光 (x 軸) 対カウント (y 軸) および対応する棒グラフは、G0/G1、S および G2/M 期の細胞周期位相分布を表します。 (B) 48 時間後の MCF-7 細胞の細胞内 ROS レベルに対する SAPE の影響を、ROS 特異的蛍光色素 (DCFDA) を使用したフローサイトメーターで分析しました。 細胞内 ROS レベルはヒストグラムで表され、棒グラフで表される対応する倍率変化はフローサイトメトリーで評価されました。 (C) MCF-7 細胞における MMP に対する SAPE の効果。 その後、フローサイトメトリーを使用してローダミン 123 の蛍光強度を 488 nm (励起) および 525 ～ 530 nm (発光) で測定し、データをヒストグラムと対応する倍率変化を棒グラフで表して表示しました。 データは平均±SEMとして表されます。対照と比較して、***P ≤ 0.001、**P ≤ 0.01、および *P ≤ 0.05 で値が有意でした。

SAPE 誘発アポトーシスにおいて ROS が果たす役割を解明するために、細胞内の ROS レベルを分析しました。 蛍光強度の増加によって証明されるように、SAPE への 48 時間の曝露の終わりに、ROS 生成が有意な方法で誘導されたことが観察されました (図 5B)。 未処理の細胞と比較して、図5Bに示すように、SAPEはROS陽性細胞の数の増加を引き起こし、MCF-7の平均蛍光強度（MFI）を1.30倍（P≤0.001）に増加させたことがわかりました。 ROS は主にミトコンドリアで生成され、ROS レベルの漸進的上昇は、アポトーシスにつながるミトコンドリア開始イベントを引き起こす可能性があります。 また、ROS の生成により、ROS の除去に関与する抗酸化物質の酵素系の恒常性が破壊される可能性があります。 証拠は、ROS の蓄積が Bax と Bcl-2 の比率の増加の結果である可能性を示唆しており、これにより MMP が減少し (「MMP 分析」セクションで明らかになるように)、さらにシトクロム C58 の放出が誘発されます。 結果は、SAPE が MCF-7 細胞の ROS レベルを大幅に上昇させる可能性があることを明確に示しており、アポトーシス プロセスにおける ROS の機能の可能性を示しています。

Δψm の損失は、Bcl-2 ファミリー内のアポトーシス促進タンパク質と抗アポトーシスタンパク質の発現間のバランスの崩壊に直接関連しているため、MMP の損失を分析しました。 Δψm の減少はミトコンドリアのチトクロム C の放出につながり、それによってアポトソームの形成が生じ、最終的にミトコンドリア媒介アポトーシスが引き起こされます 30。 ΔΨm の損失は、ミトコンドリア膜の完全性またはミトコンドリア膜の脱分極を検出するために使用されるローダミン 123 蛍光染色技術の強度の低下によって反映されました。 本研究の結果は、SAPE に曝露すると、対照と比較してミトコンドリア膜電位が大幅に低下したことを明らかにしました。 これは、最高用量のSAPEでは48時間で倍率変化が1.34倍（P≤0.001）に増加したことを示す平均蛍光強度（MFI）の変化から証明されました（図5C）。 これらの結果は、SAPE がミトコンドリア経路を介してアポトーシスを誘導する可能性があることを明確に示しており、ミトコンドリアはアポトーシスの主要な経路の 1 つであるため、これはがん治療の新しい戦略となる可能性があります。

アポトーシスまたは I 型プログラム細胞死は、生物の生理学的完全性に対する脅威となる細胞を破壊する身体に組み込まれたメカニズムです。 これは、アポトーシス促進シグナルと抗アポトーシスシグナルの間の不均衡によってスイッチがオンになります 31。 アポトーシスを特徴づける主な形態学的変化は、膜水疱形成、細胞収縮およびクロマチン凝縮を伴うアポトーシス小体の形成である 30。 結果 (図 6A) は、さまざまな用量の SAPE で処理した MCF-7 細胞が、デュアル AO/EtBr 染色で染色した場合に緑からオレンジ、赤への色変化の勾配を示し、細胞が曝露された有効濃度の影響を示していることを示しました。一方、未処理のがん細胞は緑色の蛍光を発し続けました。 したがって、SAPE の濃度の増加 (25 および 100 g/mL) により、がん細胞への損傷が有意に (P ≤ 0.001) 誘導され、細胞のアポトーシスが促進されたと解釈できます。 この核損傷は、初期のアポトーシス（低線量で見られる）から、線量が増加するにつれて後期のアポトーシスまたは壊死まで多岐にわたります（図6A）。 したがって、MCF-7細胞におけるアポトーシスの誘導により、炎症を開始することなく宿主の食作用に対してより感受性が高くなるのは、SAPEの殺腫瘍活性に起因する可能性がある。

(A) 異なる用量 (25 および 100 μg/mL)、またはビヒクル対照として 0.1% DMSO を使用した MCF-7 での SAPE のアポトーシス アッセイの 48 時間の代表的な写真。AO/EtBr 色素染色によって決定されました。 (B) 中性彗星アッセイによって検出された MCF-7 細胞の SAPE における DNA 損傷の代表的な彗星画像、および (i) 彗星の面積と (ii) 彗星の尾の長さを測定することによる DNA 損傷細胞の割合の定量化Comet ソフトウェアを開きます。 データは平均値 ± SEM として表されます。 値は、対照と比較して *P ≤ 0.05、**P ≤ 0.01、および ***P ≤ 0.001 で有意でした。

DNA 損傷を受けた細胞ではアポトーシス現象が発現するため、DNA の完全性を確認することは、潜在的な抗がん剤をスクリーニングするための有用なマーカーです 31。 さらに、DNA 損傷の誘発はがん治療の有効な手段となる可能性があります。 図 6B に示す中性コメットアッセイの結果は、3 つの異なる濃度 25 および 100 μg/mL の SAPE に 48 時間曝露した MCF-7 細胞の DNA 損傷が、それぞれの細胞に対して有意に（P ≤ 0.001）遺伝毒性があることを示しました。コメットアッセイは、個々の細胞内の異種 DNA 損傷のレベルを示し、MCF-7 細胞の DNA 損傷は、化合物に対する潜在的な腫瘍応答因子をさらに示しています 32。 これらの観察に基づいて、我々は、SAPE が MCF-7 細胞のアポトーシスを誘導できることを発見しました。 アポトーシスを調節できる抗がん剤は細胞集団の定常状態に影響を与えることができ、がんの管理や治療に効果的です。 したがって、SAPE はアポトーシスの誘導を介して MCF-7 細胞に対して抗癌活性を有すると推測できます。

オートファジーまたは II 型プログラム細胞死は、損傷したタンパク質または細胞小器官の分解を伴う、進化的に保存された細胞死の異化機構です。 がん細胞が細胞毒性物質に対して生存できるようにする保護的な役割を果たします。 オートファジー中、オートファゴソームは細胞質成分を隔離し、続いてリソソームと融合してオートリソソームを形成し、その中で飲み込まれた細胞小器官が分解されます29,30。 オートファジー阻害が MCF-7 細胞における SAPE 誘導性アポトーシスを増強するかどうかを確認するために、オートファジー分析を実行しました。 MCF-7細胞へのSAPE曝露により、オートファジー体と酸小胞の両方が大幅に増加することが観察されました。 また、図7Aに示すように、MCF-7細胞における酸性小胞小器官（AVO）の形成に対するSAPE処理の48時間の効果を、リソソーム指向性薬剤AOで染色した際の蛍光顕微鏡を使用して視覚化しました。 明らかなように、MCF7 細胞を SAPE で処理すると、液胞および凝縮ミトコンドリアの形成、クロマチンの分散、アポトーシス小体の形成、オートファジー小胞および膜小疱形成が生じました。 蛍光研究によって得られた画像を ImageJ で処理して、酸性度およびオートファゴソームの数を評価しました。 未処理の細胞は正常な核および細胞質の形態を有していたが、高濃度では細胞の酸性度が顕著に増加することが観察された（図７Ｂ）。 さらに、処理によりオートファゴソームの数が増加することも判明しました。これは酸性度の増加によるものと考えられ、これは細胞内のオートファジー微小環境をさらに反映しています。

(A) SAPE 処理 MCF-7 細胞に対する酸性小胞およびオートファゴソームを分析するための蛍光顕微鏡 (B) SAPE (25、50、100 μg/mL) で 48 時間処理した MCF7 細胞に対する酸性度の分析。 (C) SAPE (25、50、100 μg/mL) で 48 時間処理した MCF7 細胞に対するオートファジー小胞形成の分析。 (D) フローサイトメトリーを使用して 488 nm (励起) および 525 ～ 530 nm (発光) で測定した AO の平均蛍光強度。 データは (平均値 ± SEM、n = 3) として表されます。 値は、対照と比較して *P ≤ 0.05、**P ≤ 0.01、および ***P ≤ 0.001 で有意でした。

定量分析のために、フローサイトメトリーを使用して AO 蛍光を定量しました。 オートファジー性空胞の形成は、赤色蛍光強度の増加によって証明された(図7C)。 ＳＡＰＥ処理による４８時間の曝露の終わりに、蛍光強度の増加によって示されるように、オートファジー性空胞が有意に誘導されたことが観察された（図７Ｄ）。 未処理の細胞と比較して、用量範囲 25 ～ 100 μg/mL の SAPE 処理細胞では、陽性細胞のオートファジー液胞の MFi が増加しましたが（50 μg/mL で 1.48 倍）、100 μg/mL では MFi が低下したことがわかりました。 48時間の場合は0.613倍。 他の研究29,30から明らかなように、オートファジーは、さまざまな免疫療法アプローチを使用して標的とされた悪性黒色腫細胞における生存応答の制御に役割を果たしており、したがって、これらの結果は、MCF-7細胞に対する抗がん剤としてのSAPEの積極的な役割を証明しています。

足浮腫モデルによる急性炎症過程の試験について得られた結果を表３に示す。足浮腫の％の減少が、１時間目から５時間目まで、ＳＡＰＥ処置群において観察された。 ただし、有意差はカラギーナン注射後 3、4、5 時間目にのみ観察されました。 3 時間後のこの違いは、プロスタグランジンの合成または放出の阻害に関与する SAPE の作用を示している可能性があります。 初期の時間帯に有意な差が見られないのは、初期メディエーター、すなわちヒスタミン、セロトニン、またはブラジキニンに対するSAPEの影響が欠如しているためである可能性があります。 まず、カラギナン注射後の最初の 1 時間の間に、これらの初期メディエーターが放出され、続いて約 3 時間目にプロスタグランジンが放出されます。 したがって、この結果は、SAPE がプロスタグランジン合成に関与するシクロオキシゲナーゼ酵素の阻害剤として作用する可能性があることを示しています 33。

ラットの初期体重を表ＳＴ３に示す。 非ステロイド性抗炎症薬による治療後に動物の体重減少が起こる場合があります。 この体重減少は主に悪液質によって引き起こされる可能性があり、その主な原因はサイトカイン過剰による可能性があります 34。 しかし、図 SF12 に見られるように、時間の経過とともに体重のパーセンテージの着実な増加が 3 つのグループすべてで観察されました。 しかしながら、増加は、SAPE治療群およびインドメタシン治療群と比較して、対照群の方が高かった。 クローン病 (CD) や潰瘍性大腸炎 (UC) などの炎症性腸疾患 (IBD) は、特定の時点での疾患活動性の評価に役立つ疾患活動性指数 (DAI) を使用してマークされます 35。 ＤＡＩスコア基準およびラットの異なる治療群のＤＡＩスコアをそれぞれ表ＳＴ４および表ＳＴ５に示す。 いかなる治療も受けていない大腸炎誘発群（RG-CI）は、DAI の最高スコア 2.42 をマークしたのに対し、対照群では 0 であったことがわかりました。SAPE（1.04 DAI）治療群とインドメタシン（0.92 DAI）治療群の両方が記録しました。 RG-CIグループよりスコアが低かった。 したがって、ラットモデルがSAPEによる前処置を受けた後、誘発された疾患の程度には顕著な差があった。

治療および安楽死後の異なるラット群の切除腸とそのSEM画像を図8に示します。大腸炎誘発群（RG-CI、RG-SPおよびRG-IM）では、ある程度の組織損傷および破裂が観察されました。 ）、これは対照群では見られませんでした。 いかなる治療も受けていない大腸炎誘発群と比較して、SAPE およびインドメタシン治療群の SEM 画像では、組織損傷レベルの顕著な減少が示されました。 これは、SAPE による治療後に大腸炎の程度が顕著に減少したことを明確に示しています。

(A) RG-CF (無治療の大腸炎対照群) ラット、(B) RG-CI (無治療の大腸炎誘発群) ラット、(C) RG-SP ( ＲＧ−ＩＭ（インドメタシンで処置した大腸炎誘発群）ラット、ＳＡＰＥで処置した大腸炎誘発群）ラット。

炎症誘発性の酸化損傷は、酸化ストレスに関連する状態でフリーラジカルスカベンジャーとして機能するカタラーゼ (CAT)、グルタチオン S-トランスフェラーゼ (GST)、ガンマ-グルタミルトランスフェラーゼ (GGT) などの抗酸化酵素活性の低下によって悪化します 36。 多価不飽和脂肪酸、糖脂質、リン脂質、コレステロールは過酸化修飾のよく知られた標的であり 37、最も一般的な標的は生体膜の成分です 38。 脂質の過酸化により、アルデヒドなどのさまざまな二次酸化生成物が生成されますが、その中で最も変異原性が高いのはマロンジアルデヒド (MDA) です 37。 MDA は、酵素的または非酵素的プロセスによるアラキドン酸およびより大きな PUFA の分解によって最終生成物として生成される低分子量のアルデヒドです。 過剰な MDA 産生はさまざまな病理学的状態と関連しており、いくつかの疾患に罹患した被験者の MDA レベルは増加しています。 したがって、チオバルビツール酸 (TBA) と容易に反応するため、脂質過酸化の便利なバイオマーカーとして使用されています 37,38。 ラットの異なる治療群についての腸組織抽出物中のMDA含有量のアッセイの結果を図9aに示す。 すべてのグループ間で MDA の含有量に有意差 (P ≤ 0.05) があることがわかりました。 何も治療を行わなかった大腸炎誘発群は最も高い含有量（0.26 pg/μl）を示しましたが、その含有量はインドメタシン治療群（0.16 pg/μl）と比較して、SAPE 治療群（0.10 pg/μl）の方が低かったです。 したがって、SAPE は炎症組織における脂質過酸化の強力な阻害剤と考えられます。 CAT は、細胞内および細胞外環境から有毒な過酸化水素を排除することで細胞を酸化ストレスから保護する主要な抗酸化防御成分であるため、細胞内の酸化ストレスの高感度バイオマーカーと考えられています 36,39。 ラットの異なる治療群における腸組織抽出物中のカタラーゼ（CAT）濃度のアッセイの結果を図9bに示す。 すべてのグループ間で CAT の含有量に有意差 (P ≤ 0.05) があることがわかりました。 何の治療も受けていない大腸炎誘発グループは最も低い含有量 (35.25 mU/mL) を示しましたが、対照グループは最も高い含有量 (201.25 mU/mL) を記録しました。 この含量は、インドメタシン治療群（152.00 mU/mL）と比較して、SAPE治療群（168.75 mU/mL）で再び高かったため、抗酸化酵素CATの合成および活性におけるSAPEの積極的な役割が示されました。

(a) マロンジアルデヒド (MDA) 含有量。 (b) カタラーゼ (CAT) 含有量。 (c) γ-グルタミルトランスフェラーゼ (GGT) 活性。 (d) グルタチオン S-トランスフェラーゼ (GST) 活性。 （e）ラットのさまざまな治療群の腸組織抽出物中の腫瘍壊死因子アルファ（TNF-α）含有量および（f）インターロイキン6（IL-6）含有量（RG-CI：治療を行わない大腸炎誘発群、RG- CF: いかなる治療も行わない大腸炎のない対照群; RG-SP: SAPEで治療した大腸炎誘発群; RG-IM群: インドメタシンで治療した大腸炎誘発群)。

GGT は、結合型 GSH からアミノ酸やジペプチドなどの受容体へのガンマ-グルタミル部分の移動を触媒するため、グルタチオン (GSH) の細胞外異化に寄与します。 また、GSH をその構成アミノ酸に分解し、律速アミノ酸である GSH40 の新規合成を提供します。 血清中の GGT レベルは、炎症、アルコール性肝疾患、胆嚢および胆道の疾患、血漿脂質/リポタンパク質含有量、高血圧、高尿酸血症、糖尿病、さまざまな薬剤などのいくつかの要因によって決定されます 40,41。 ラットの異なる治療群についての腸組織抽出物中のGGT活性のアッセイの結果を図9cに示す。 すべてのグループ間で GGT の含有量に有意差 (P ≤ 0.05) があることがわかりました。 いかなる治療も行わなかった大腸炎誘発グループは、最高の含有量 (13.32 nmole/unit/mL) を記録しました。 SAPE 処理グループ (5.21 nmole/unit/mL) とインドメタシン処理グループ (6.39 nmole/unit/mL) の両方の含有量は、対照グループ (2.16 nmole/unit/mL) より高かった。 あるいは、GST は、求電子性基質の GSH への結合を触媒する主要な第 II 相解毒酵素であり、ペルオキシダーゼおよびイソメラーゼ活性、H2O2 誘発細胞死から細胞を保護する機能、内因性および外因性リガンドの非触媒結合などの他の機能も備えています。 。 これらは GSH 結合体の形成をもたらし、最終的には ATP 依存性 GS-X ポンプなどのいくつかの輸送機構によって除去されます 42,43。 ラットの異なる治療群についての腸組織抽出物中のGST活性についてのアッセイの結果を図9dに示す。 GST 活性にはすべてのグループ間で有意差 (P ≤ 0.05) が観察されました。 対照群は最も低い活性（0.17 μmole/mL/min）を記録しましたが、治療を行わなかった大腸炎誘発グループは最も高い活性（0.29 μmole/mL/min）を示しました。 しかしながら、活性は、インドメタシン処理群（０．２４μモル／ｍＬ／分）よりもＳＡＰＥ処理群（０．２６μモル／ｍＬ／分）の方が高かった。 細胞における GGT および GST の誘導は、通常の代謝中に生成される酸化物質、または ROS44 の存在などの要因により酸化ストレスが増加した場合に生成される酸化物質に対する保護適応として発生します。得られた結果は、酸化ストレスのレベルが低下することを示唆しています。病気の状態でのSAPEの適用。

サイトカインは、炎症過程で生成される急性期タンパク質の生成を刺激します。 これらの炎症関連サイトカインには、インターロイキン-6 (IL-6)、IL-1β、腫瘍壊死因子-α (TNF-α)、インターフェロン-γ、トランスフォーミング増殖因子-β、IL-8、コロニー刺激因子および増殖因子が含まれます。 。 機能的な多面発現性と冗長性は、これらのサイトカインの特徴的な特徴です 45,46。 TNF-α は、自然免疫応答に関与する炎症促進性サイトカインです 47。 マクロファージは TNFα の主要な生産者であり、細胞レベルでは、2 つの膜貫通受容体、TNF-R1 および TNF-R2 によって媒介される、細胞の生存、細胞増殖、分化、アポトーシスを含む多くの重要な細胞機能を制御します。 一般に、TNFα は細胞の死滅を引き起こしませんが、遺伝子の転写と細胞の活性化を促進します 9,48。 病的状態下では、TNFα産生とTNF受容体シグナル伝達がマクロファージ機能の多くの側面を調節します。 クローン病、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、敗血症、乾癬、糖尿病、肥満などの多くの炎症性疾患において、炎症誘発性サイトカイン カスケードの生成を調整する上で極めて重要な役割を果たしています。 これは、外傷、感染、または細菌由来の LPS48 への曝露後に急速に放出されるため、炎症組織に最も豊富に存在する初期メディエーターの 1 つです。 ラットの異なる治療群についての腸組織抽出物中のＴＮＦ－α含有量のアッセイの結果を図９ｅに示す。 TNF-α含量は対照群で最も低かった(7.65 pg/mL)。 ＳＡＰＥ（１４．６６ｐｇ／ｍＬ）およびインドメタシン（１３．７５ｐｇ／ｍＬ）処置群の両方におけるＴＮＦ－α含量は、何の処置も行わなかった大腸炎誘発群（２２．２８ｐｇ／ｍＬ）よりも低かった。

IL-6 は炎症部位で産生される多面発現性サイトカインであり、急性期応答、免疫応答の制御、および造血において重要な役割を果たしています 49。 また、代謝、再生、神経プロセスの調節にも関与しています。 急性期の変化は炎症の存在と強度を反映しており、IL-6 はほとんどの急性期タンパク質の産生の主な刺激因子です 45。 IL-6 は、感染、外傷、免疫学的チャレンジなどの刺激後にさまざまな細胞によって産生される可能性があります。 また、マウスの LPS ガラクトサミン敗血症性ショックモデルにおいて保護的な役割を果たすこともわかっています 49。 ラットの異なる治療群についての腸組織抽出物中のIL-6含有量のアッセイの結果を図9fに示す。 その含有量は対照群で最も低かった (26.91 pg/mL)。 SAPE (90.76 pg/mL) 処置群とインドメタシン (82.83 pg/mL) 処置群の間には含量に有意差はなく、どちらも無処置の大腸炎誘発群 (109.56 pg/mL) よりも含量がはるかに低いことが明らかになりました。 IL6 および TNF-α アッセイの両方の結果は、SAPE による治療後の炎症レベルの低下を明確に示しました。

Zn(OTf)2 触媒による選択的エステル化は、サリチル酸フェニルエチル エステル (SAPE) の製造に成功裏に採用されました。 このエステルは細胞毒性がなく、抗炎症作用と抗酸化作用が期待できることが判明し、その結果は確立されたNSAID薬と同等でした。 このエステルは、G1 未満の細胞周期停止、MMP の減少、ROS の蓄積、アポトーシスとオートファジーの誘導を介して、MCF7 乳がん細胞に対して抗がん活性を示しました。 この結果は、この特定のエステルの潜在的な抗炎症剤および癌治療剤としての使用についての洞察を初めて提供するものである。 SAPE の細胞取り込みと代謝を解明するさらなる研究は、このエステルが NSAID であることを裏付けるのに役立つでしょう。

初代末梢血単核球 (PBMC) を取得するためのヒト血液サンプルは、インド、アッサム州のテズプール大学の保健センターで自発的に収集されました。 胎児性ヒト肝がん細胞株 (HepG2)、上皮性結腸直腸腺がん細胞株 (CaCo-2)、および上皮性乳がん細胞株 (MCF-7) は、インドのプネーにある国立細胞科学センター (NCCS) から入手しました。 動物細胞培養用の培地はインドの HiMedia から購入し、化学物質と溶媒は米国の Sigma Aldrich およびドイツの Merck から入手しました。

N2 雰囲気下でサリチル酸 (1.0 当量) を、乾燥アセトニトリル (10 mL) 中の I2 (2.0 当量) およびトリフェニルホスフィン (2.0 当量) の撹拌溶液に加え、反応混合物を 10 分間ボルテックスし、次に Zn(OTf) ２（５モル％）を添加した。 撹拌を６０℃で３０分間続け、次いで乾燥アセトニトリル中のフェニルエチルアルコール（１．１当量）を加えた。 反応の完了後(TLCで監視)、混合物を30℃に冷却し、溶媒を減圧下で除去した。 残渣を酢酸エチルに溶解し、飽和ＮａＨＣＯ３、続いてブライン溶液で洗浄した。 有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空下で濃縮した。 シリカゲルおよび酢酸エチルからヘキサンへの勾配溶媒系を用いたカラムクロマトグラフィーにより、標的化合物 50 が得られ、「SAPE の構造検証のための NMR および FTIR 研究」セクションで述べたように検証されました。

13 C および 1 H NMR 研究は、NMR 分光光度計 (ECS-400、日本電子、日本) で実施し、データ収集に使用したソフトウェアは Delta, Ver. 2 でした。 4.3.6. 試験化合物をＮＭＲグレードのクロロホルムに溶解し、電界強度を９．３８９７６６［Ｔ］（４００ＭＨｚ）に設定した。 FTIR 測定値は、FTIR 分光光度計 (Spectrum 100、Perkin Elmer、米国) で取得されました。 データは吸光度 (A) モードで収集され、選択された波長範囲は 4000 ～ 400 cm-1 でした。 サンプルあたりの解像度とスキャン数は、それぞれ 4 cm-1 と 4 でした。

分子ドッキング シミュレーションでは、SAPE、インドメタシン、およびイブルポフェンの構造を ChemOffice 2010 (Cambridge Soft、マサチューセッツ州、米国) を使用して生成しました。 次に、化合物はドッキング シミュレーション用に 3D 形式に変換され、MM2 力場法 51 を使用してその形状が最適化され、sybyl mol2 として保存されました。 SAPE に関連するインシリコ ADME-Tox テストは、ソフトウェア ACD/Labs I-Lab 2.0 (Advanced Chemistry Development Inc、トロント、カナダ) を使用して実施されました。

SAPE、および他の 2 つの確立された抗炎症剤、つまりインドメタシンとイブルポフェンの分子ドッキングを、Molegro Virtual Docker (MVD) 6.01 (CLC bio、オーフス、デンマーク) を使用して COX-2 (PDB ID: 4PH9) に対して実行しました。 タンパク質をカバーするために解像度 0.8 Å の離散グリッドを使用し、その後半径 1.4 Å の球を配置することによって、グリッド ベースの空洞予測アルゴリズムを使用しました。 球体が他の球体と重なり合っているかどうかがチェックされ、見つかった空洞はその体積に従ってランク付けされました21。 ドッキング シミュレーションでは、結合と側鎖の許容値が 1.7、強度が 0.7 に設定され、複数のクラスターの姿勢に対する二乗平均平方根偏差 (RMSD) のしきい値が 2.00 Å に設定されました。 ドッキング アルゴリズムは、各化合物について最大反復数 1,500、シンプレックス展開サイズ 50、最小実行数 100 に設定されました。 分子ポーズは MolDock および Rerank スコアに基づいてランク付けされ、視覚化され、リガンドとタンパク質の相互作用分析のために上位のドッキング ヒットが選択されました。

タンパク質-リガンドドッキング複合体に対する上位のドッキングヒットについて、MD シミュレーション研究が実施されました。 リガンドトポロジーと原子電荷は、PRODRG サーバー 52 を使用して生成されました。これにより、電荷値は最大に設定され、キラリティーはエネルギー最小化なしのデフォルト値に設定されました。 この系は、タンパク質 - リガンド系が水に浸漬され、エネルギーが最小化された Gromos 43a1 力場を使用して処理され、続いて NVT (正準) 平衡および NPT (等温 - 等圧) 平衡が行われました。 平衡構造は 20 ns MD シミュレーションを受け、その軌跡が解析され、RMSD バックボーンに対してプロットされました。

最適なドッキング ポーズ SAPE の立体配座がエクスポートされ、Gaussian 09 を使用して DFT 計算が実行されました。理論計算は、DFT/B3LYP/6-31 基底関数セットを使用して Ground State で実行されました。 推測方法は、HOMO と LUMO 軌道を混合した拡張ハッケルとして設定されました。 分子軌道エネルギーは、バンドエネルギーギャップΔELUMO-HOMOを計算するために考慮されました。

ヒト血液の使用に必要な倫理委員会の許可は、テズプールのテズプール大学倫理委員会 (TUEC) から得ました (プロトコル番号 DoRD/TUEC/10-14/4361、日付 2014 年 3 月 28 日)。 この実験に必要な末梢血単核球 (PBMC) および赤血球 (RBC) を取得するために献血するために、すべてのボランティアから事前に説明された同意を得ました。 すべての細胞は、37 °C、5% CO2 の安定した環境で培養されました。 PBMC を密度勾配遠心分離によって分離し、96 ウェル プレート内の 10% FBS を補充した RPMI-1640 培地 (3 × 103/200 µL) に播種しました。 CaCo-2 細胞は 20% ウシ胎児血清を含む MEM 培地で培養し、HepG-2 細胞は DMEM 培地で培養し、MCF-7 細胞は 10% FBS、100 U/mL ペニシリン、および 100 mg/mL を含む MEM 培地で培養しました。 Lストレプトマイシン。

ＲＢＣを血液から単離し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、次いで２％の赤血球懸濁液（ＥＳ）を生理食塩水に再懸濁した。 反応混合物には、96 ウェルマイクロプレートに 100 μL の ES、0.1% Triton X-100 および 25、50、または 100 μg/mL の SAPE が含まれており、一定の撹拌下、37 °C で 60 分間インキュベートし、その後 2000 rpm で遠心分離しました。 10分。 ヘモグロビンの放出は、576 nm での上清の測光分析によって測定されました。 0.1% Triton X-100 (陽性対照として) と PBS (陰性対照として) を使用して、それぞれ 100% と 0% の溶血を達成しました53。

PBMC、HepG-2、CaCo-2、および MCF-7 細胞 (2 × 103) を 96 ウェル プレートに播種し、濃度を増加させて (25、50、100、200 μg/mL) の SAPE で 48 時間処理しました。 37 °C、5% CO2。 その後、20 μL (PBS 中 5 mg/mL) の MTT 溶液を各ウェルに添加し、37℃で 4 時間インキュベートしました。 培地を除去した後、ホルマゾンをDMSOに溶解し、570 nmで光学密度を測定しました。 細胞生存率阻害率は、薬物を含まない培地で培養した対照細胞と比較して計算されました54。

MCF-7 細胞の生存率に対する SAPE の効果も、トリパン ブルー色素排除アッセイによって評価されました。 細胞 (2 × 103) を、0.1% DMSO 中のさまざまな濃度 (25、50、および 100 μg/mL) の SAPE で培養し、48 時間インキュベートしました。 次に、合計 0.2 ml のトリプシン処理細胞溶液を、PBS 中の 0.4% トリパンブルー 0.5 mL と混合し、5 分後、血球計を使用して染色 (死細胞) 細胞と未染色 (生細胞) を計数しました 31。

化合物、すなわち。 SAPE、サリチル酸、およびフェニルエチル アルコール (25、50、および 100 μg/mL) の COX-2 産生阻害効果を試験し、インドメタシンと比較しました。 刺激細胞アッセイでは、CaCo-2 細胞を、前述したように (「PBMC、HepG-2、CaCo-2 および MCF-7 細胞の培養」セクション)、試験化合物の存在下および非存在下で MEM 培地中でプレインキュベートしました。 1時間。 次に、大腸菌 0111 由来のリポ多糖類 (LPS): B4 (10 μg/mL) を細胞懸濁液に添加し、さらに 37 °C、5% CO2 で 48 時間インキュベートしました。 培地を除去した後、細胞をＰＢＳで洗浄し、氷冷した細胞抽出緩衝液（０．１ｇ／ｍｌ）に加え、ビーズビーター（６０７ＥＵＲ、ＢｉｏＳｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ＵＳＡ）を使用して溶解した。 組織溶解物の上清を遠心分離（12,000 × g、4 °C で 10 分間）によって収集し、ヒト COX-2 ELISA キット（RAB1034、Sigma-Aldrich、USA）を使用して以下のように Cox-2 の放出を測定しました。製造業者の指示および測定値は、マイクロプレートリーダー（GloMax Explorer、Promega、米国）で取得された。

COX-2 の直接隔離アッセイには、蛍光分析 COX-2 阻害剤スクリーニング キット (MAK399、Sigma Aldrich、米国) を使用しました。 このアッセイは、COX 酵素によって生成される中間生成物であるプロスタグランジン G2 の蛍光検出に基づいていました。 すべてのアッセイパラメーターはメーカーの指示に従って実行され、蛍光はマイクロプレートリーダーを使用してカイネティックモードで、λEx = 535 nm/λEm = 587 nm、25 °C、5〜10分間で直ちに測定されました。 各化合物のＩＣ５０値は、ソフトウェアＣｏｍｐｕＳｙｎ（ＣｏｍｂｏＳｙｎ，Ｉｎｃ．）を使用して計算した。

1 × 105 細胞/ウェルの MCF-7 細胞をさまざまな濃度 (25、50、および 100 μg/mL) の SAPE で処理しました。 48 時間のインキュベーション後、付着細胞と浮遊細胞の両方をトリプシン処理によって収集し、氷冷 PBS で 2 回洗浄し、氷冷 70% メタノール中で -20℃ で一晩固定し、その後ヨウ化プロピジウム (20 μg/mL) とインキュベートしました。 RNase A (200 µg/mL) を 37 °C でさらに 30 分間処理します。 次いで、細胞周期分布をフローサイトメーター（BD FACS LSR III、BD Biosciences、米国）によって分析した。 最後に、細胞周期のさまざまな段階にある細胞の割合を BD Diva ソフトウェアによって決定しました。

細胞間 ROS 生成を定量的に検出するために、MCF-7 細胞を 6 ウェル培養プレートに 1 × 105 の密度で 24 時間播種し、その後さまざまな濃度 (25、50、および 100 μg/mL) の SAPE で処理しました。 48時間。 続いて細胞をトリプシン処理し、PBSで洗浄し、暗所、37℃で30分間、25 mM ジクロロフルエン二酢酸で染色し、細胞の相対ROSレベルをFCA 30で定量しました。

前の「細胞周期分析」セクションで述べたように、MCF-7 細胞の処理に続いて、400 μl の 50 μM ローダミン 123® とともに 37 ℃で 30 分間、5 分間隔で垂直に振盪しながらインキュベートしました。 次に細胞を PBS で 3 回洗浄し、励起波長と発光波長をそれぞれ 488 nm と 525 ～ 530 nm に固定して、ローダミン 123® の蛍光強度を FCA によって測定しました。 したがって、平均蛍光強度 (MFI) は、細胞内ミトコンドリア膜電位 (MMP) 30 の細胞レベルを表します。

2.5.1 で述べたように、MCF-7 細胞 (1 × 105 細胞/mL) をさまざまな濃度 (0、50、および 100 μg/mL) の SAPE で処理しました。 その後、細胞を15℃、3000 rpmで5分間遠心分離し、ペレットをPBSで2回洗浄しました。 ペレットを 50 μL の PBS に再懸濁し、懸濁液のうち 25 μL を 2 μL のアクリジン オレンジ (AO) および臭化エチジウム (EB) 混合物 (100 μg/mL-1:1) と 10 分間混合し、保存しました。 37℃のインキュベーター内。 次に、細胞をカバースリップを備えたスライドガラス上にマウントし、蛍光顕微鏡 (Leica DM300、ドイツ) で観察しました 30。

蛍光顕微鏡による細胞内オートファジーの定性分析 29 では、カバースリップをロードした 6 ウェル プレートに細胞を 1 × 105 細胞/ウェルで播種することでイメージングを実現しました。 その後、細胞を SAPE で処理し、4.6.1 に示すように処理しました。 最後に、PBS で洗浄した後、細胞を AO で染色し、顕微鏡に取り付け、複合顕微鏡 (Leica DM3000、USA) で適切なフィルター設定を使用して画像をキャプチャしました。

続いて、2.5.1 と同様に、MCF-7 細胞 (1 × 105 細胞/mL) をさまざまな濃度 (0、50、および 100 μg/mL) の SAPE で処理しました。 ここでは、培地を除去し、細胞を1μg/mLのAOで37℃で15分間染色し、その後PBSで洗浄し、すぐにFCAで分析しました。

これは、Olive と Banáth32 に従って行われました。 簡単に説明すると、0.4 mL の MCF-7 細胞 (2 × 104 細胞/mL) を 1.2 mL の 1% アガロースと 40 °C で混合し、この細胞懸濁液 1.2 mL をアガロースで覆われたプレプレートの表面に沈降させました。コーティングされた (1% アガロース) スライド。 次に、スライドを溶解溶液 (2% サルコシル、0.5 M Na2EDTA および 0.5 mg/ml プロテイナーゼ K、pH 8.0) に 4 ℃ で静かに浸し、暗所で 37 ℃ で 20 時間インキュベートしました。 次いで、それを電気泳動緩衝液（ｐＨ８．５）に３０分間浸漬し、同じ緩衝液中で２５分間電気泳動に供した。 染色は蒸留水中の 2.5 μ/mL ヨウ化プロピジウムで行い、Open Comet ソフトウェアを使用して個々の彗星画像の彗星の面積と彗星の尾の長さを調べることにより細胞を分析しました (スライドあたり 50 個の彗星画像)。

動物実験は、アッサム州テズプールの防衛研究所（CPCSEA登録番号：1127/bc/07/CPCSEA）でアルビノラット（ウィスター種のドブネズミ）を用いて実施された。 動物実験を実施するために必要な倫理委員会の許可は、テズプールの国防研究所の動物倫理委員会 (IAEC) から得られました (2016 年 3 月 6 日付けのプロトコル no. 01/May/2016)。 すべての実験は、関連するガイドラインと規制に従って実行されました。 さらに、ラットを含む研究の報告は、ARRIVE ガイドラインに記載されている推奨事項に従って行われました。

ラット（生後２ヶ月）を、（２０±１）℃、（６０±５）％相対湿度および明暗（１２時間：１２時間）サイクルの特定の病原体のないバリア条件で飼育した。 げっ歯類の餌と水を自由に与えた。 薬物投与の前治療モデルが使用され、男性と女性の数が同じになるようにランダム化された方法で 5 つのグループに分けられました。 グループ RG-CI: いかなる治療も受けていない大腸炎誘発グループ (n = 8)。 RG-CF グループ: いかなる治療も受けていない大腸炎のない対照グループ (n = 8)。 RG-SP グループ: SAPE で治療した大腸炎誘発グループ (n = 8)。 グループ RG-IM: インドメタシンで治療した大腸炎誘発グループ (n = 8) および RG-PO: 足浮腫誘発モデル グループ (n = 8)。

異なる群のラット (n = 8) に、両左足の外果の直下の足底下領域に 0.15 mL の 0.1% カラギーナンを注射することにより、足浮腫を誘発しました。 次に、SAPE とインドメタシン (10 mg/kg 体重) を経皮経路で投与しました。 デジタル体積脈波計 (Orchid Scientific、インド) を使用して、足の体積を 0、1、3、および 5 時間で測定し、浮腫% を Upadhyay et al. 55 に従って表しました。

１日目から１６日目まで、ＳＡＰＥおよびインドメタシンを、体重１ｋｇ当たりそれぞれ２５０ｍｇおよび１．５ｍｇの用量で各群（ＲＧ－ＳＰ群およびＲＧ－ＩＭ群）の全メンバーに与えた。 最後の投与から4時間経過した後、RG-CI、RG-SP、RG-IM群のラットに、体重1kg当たり5mgの用量で大腸菌0111:B4由来のLPSを腹腔内注射してチャレンジした。 すべてのラットは、24 時間の LPS 攻撃の後、CO2 窒息により安楽死させられました。 死後、結腸および小腸を解剖し、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含むペニシリン/ストレプトマイシン (100 IU/mL ペニシリンおよび 100 μg/mL ストレプトマイシン) を含む冷 1 × PBS で洗い流し、次に縦に開いて PBS で十分に洗浄しました。 肛門から 2 cm 離れた腸部分 (0.5 ～ 1.0 cm) を収集し、10% 中性緩衝ホルマリンで固定しました。 組織は発熱物質やエンドトキシンを含まないチューブに保存され、分析前に –80 °C で冷凍保存されました。

すべてのラットの体重を治療前に毎日記録し、体重増加率を計算した。 DAI スコアは、体重減少、便の硬さ、便出血の合計スコアを加算し、この合計を 356 で割ることによって計算されました。

組織を３％グルタルアルデヒドで固定し、０．１Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液で洗浄し、０．１Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液中の０．１％四酸化オスミウムで再度固定した。 一連の 30 ～ 100% アセトン中で脱水し、その後 4 °C のテトラメチルシラン中で乾燥させました。 微細構造は、走査電子顕微鏡 (JEOL JSM-6390LV、SEM、オックスフォード) を使用して、倍率 500 × および 1000 ×、加速電圧 20 kV で調査されました。

脂質過酸化のレベルは、形成されたマロンジアルデヒド（MDA）の量として表され、これは、0〜20 nmoleの範囲のMDAの標準曲線を使用する脂質過酸化アッセイキット（MAK085、Sigma-Aldrich、USA）を使用して分析されました。 。 カタラーゼ（CAT）の含有量はカタラーゼアッセイキット（A22180、Invitrogen、USA）を用いて測定し、酵素1単位を定義したカタラーゼの標準曲線（0～4.0 U/mL）からカタラーゼ濃度を算出した。 pH 7.0、温度 25 °C で 1 分あたり 1.0 μモルの H2O2 を分解する量として。 γ-グルタミルトランスフェラーゼ（GGT）活性のアッセイは、GGT アッセイキット（MAK089、Sigma-Aldrich、USA）および pNA 標準曲線（0 ～ 40 nmole/ウェル）を使用して実行されました。ここで、GGT の 1 単位は量として定義されます37 °C で 1 分あたり 1.0 μモルの pNA を生成する酵素の量。 グルタチオン S-トランスフェラーゼ (GST) 活性アッセイは、GST アッセイ キット (CS0410、Sigma-Aldrich、USA) を使用して実行し、GST 比活性は 1-クロロ-2,4-ジニトロベンゼンのモル吸光係数を使用して計算しました。 (CDNB)-GST コンジュゲート。

組織を、ＲＩＰＡ緩衝液および１ｍＭ ＰＭＳＦを用いて超音波処理することによってホモジナイズした。 ライセートを 13,000 × g で遠心分離し、分析前に上清を標準希釈バッファーで 1:10 ～ 1:100 倍にさらに希釈しました。 インターロイキン 6 (IL-6) のアッセイは、マウス IL-6 ELISA キット (KMC0061、Invitrogen、米国) および Ms IL-6 標準曲線 (0 ～ 250 pg/mL) を使用して実行されました。 腫瘍壊死因子アルファ (TNF-α) は、マウス TNF-α ELISA キット (KMC3011、Invitrogen、米国) および Ms TNF-α 標準曲線 (7.8 ～ 250 pg/mL) を使用してアッセイされました。

すべての結果は平均±SEMとして表されました。 統計分析は、Mann-Whitney U 検定後の ANOVA を使用して実行されました。 P < 0.001、P < 0.01、および P < 0.05 の値は、グループ間の有意差を示すとみなされました。

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著者らは、インドのアッサム州にある国防研究所の所長と、インドのアッサム州にあるテズプール大学分子生物学およびバイオテクノロジー学部のアナンド・ラムテケ教授から、それぞれ動物実験と細胞株研究の実施を親切に許可していただいた援助に正式に感謝します。 。

テズプール大学、食品工学および技術学部、テズプール、アッサム州、インド

アラップ・ジョティ・ダス & サンカル・チャンドラ・デカ

テズプール大学、分子生物学およびバイオテクノロジー学部、テズプール、アッサム州、インド

マネー・クマール・ダス & サラーム・プラディープ・シン

インド、アッサム州ティタバール、NN Saikia College、化学科

パルタ・プラティム・サイキア

ジャワハルラール ネルー大学環境科学部、ニューデリー、インド

ニール・シン & パウルラージ・ラジャマニ

製薬技術部門、防衛研究所、テズプール、アッサム州、インド

ジョヒルル イスラム & プロノベシュ チャットパディヤイ

テズプール大学物理学科、テズプール、アッサム州、インド

アフタブ・アンサリ

静岡理工科大学物質生命科学科（袋井市）

Tatsuro Miyaji

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AJD と PPS が概念化を行いました。 AJD、SPS、MKD、AA は方法論を策定し、正式な分析と調査を実施しました。 PR と NS はデリーの JNU で細胞株研究を監督しました。 JI と PC は DRL, T. での動物関連実験を監督した。 SCD と TM はリソースを利用できるようにし、作業全体を監督しました。 AJD と SCD が執筆、つまり原案の準備を行い、著者全員が原稿をレビューしました。

サンカル・チャンドラ・デカへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

オープン アクセス この記事はクリエイティブ コモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブ コモンズ ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。 この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれています。 素材が記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。 このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

ダス、AJ、ダス、MK、シン、SP 他サリチル酸フェニルエチルエステル (SAPE) の合成と免疫調節および抗がん作用におけるその関与。 Sci Rep 12、8735 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-12524-7

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受信日: 2021 年 8 月 26 日

受理日: 2022 年 4 月 18 日

公開日: 2022 年 5 月 24 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-12524-7

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